一种NOD遗传背景双基因缺陷小鼠模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种NOD遗传背景双基因免疫缺陷小鼠模型的制备方法，利用基因编辑技术敲除NOD小鼠的RAG1基因的第2号外显子全部编码区DNA片段以及JAK3基因上包括18‑21号外显子序列在内的DNA片段；敲除的后的RAG1基因序列如SEQ ID NO:9所示，敲除的后的JAK3基因序列如SEQ ID NO:10所示。NOD遗传背景小鼠中利用CRISPR/Cas9系统同时敲除RAG1与JAK3基因在国内外尚属首次，这也是首例RAG1和JAK3双敲基因的纯合子小鼠免疫缺陷小鼠模型，具有很高的原创性和非常重要的基础研究和实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种NOD遗传背景双基因缺陷小鼠模型的制备方法及应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种NOD遗传背景中RAG1基因与JAK3基因同时缺失的小鼠模型的制备方法及应用。
技术介绍
RAG1基因(recombinationactivatinggene1,重组活化基因1)位于小鼠2号染色体，包含2个外显子，编码区全部位于2号外显子，该基因编码由1040个氨基酸残基组成的Rag1蛋白。淋巴细胞独有的体细胞DNA重排现象也称为V(D)J重组，是免疫反应中B细胞产生抗体和T细胞受体多样性的分子基础。Rag1与其家族蛋白Rag2组成异二聚体，参与免疫球蛋白V(D)J重组过程中的DNA切口的引入(Ru,H.,P.Zhang,andH.Wu,StructuralgymnasticsofRAG-mediatedDNAcleavageinV(D)Jrecombination.CurrOpinStructBiol,2018.53:178-186；Schatz,D.G.,M.A.Oettinger,andD.Baltimore,TheV(D)Jrecombinationactivatinggene,RAG-1.Cell,1989.59(6):1035-48.)，可以发生V(D)J重组的基因座包括B淋巴细胞的免疫球蛋白重链、κ和λ轻链，以及T淋巴细胞的T细胞受体α、β、γ和δ链。该基因缺失小鼠，由于V(D)J重组过程受阻而不能产生成熟的T细胞。由于没有T细胞的辅助，B细胞的成熟也会受影响(Mombaerts,P.,etal.,RAG-1-deficientmicehavenomatureBandTlymphocytes.Cell,1992.68(5):869-77)。但Rag1功能缺失并不会影响天然免疫反应系统，比如NK细胞的成熟，在Rag1缺失小鼠的非淋巴组织中甚至能观察到NK细胞数量有所增加(Grundy,M.A.andC.L.Sentman,ImmunodeficientmicehaveelevatednumbersofNKcellsinnon-lymphoidtissues.ExpCellRes,2006.312(19):p.3920-6)。JAK3基因位于小鼠8号染色体，包含23个外显子，其编码蛋白属于Janus激酶家族成员的受体酪氨酸激酶。其中Jak3蛋白主要表达在免疫细胞中，是细胞因子IL-2/4/7/9/15/21gamma受体亚单位的下游信号分子，介导受体/JAK3/STAT信号通路。由于骨髓中NK前体细胞成熟需要IL2/4/15/21的刺激，胸腺中T细胞的成熟需要IL2/4/7/15/21参与。JAK3基因功能受损直接影响这些细胞因子的信号传导。因此，JAK3基因突变个体可出现T、B细胞和NK细胞的缺失(Thomis,D.C.,etal.,DefectsinBlymphocytematurationandTlymphocyteactivationinmicelackingJak3.Science,1995.270(5237):794-7；Robinette,M.L.,etal.,Jak3deficiencyblocksinnatelymphoidcelldevelopment.MucosalImmunol,2018.11(1):50-60.)。NOD小鼠是日本学者对远交系Jcl：JCR鼠进行近交培育第6代时从白内障易感亚系中分离出非肥胖糖尿病品系(NOD)和非肥胖正常品系(nod)，是I型糖尿病研究和人源化模型建立中使用最为广泛的小鼠品系，目前一些经典的人源化小鼠模型如NOG和NSG等均是在NOD小鼠遗传背景中制作获得的。目前世界范围内还没有关于RAG1基因与JAK3基因同时缺失的免疫缺陷小鼠模型制作成功的报道。这是由于NOD小鼠是Ⅰ型糖尿病小鼠，单独敲除JAK3后的纯合子小鼠，生长至6-7周就会患有糖尿病，导致新生仔死亡率很高；该小鼠9-12周时，肚子非常大，根本无法怀孕。因此，RAG1基因敲除的纯合子与JAK3基因敲除的纯合子很难整合在同一只小鼠上。所以，在NOD遗传背景小鼠中制作获得RAG1基因与JAK3基因同时缺失的免疫缺陷小鼠模型，将为开启此类小鼠在异种移植中的研究提供更好的小鼠模型，也为人源化小鼠的研究开启全新的视野。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种NOD遗传背景下RAG1基因与JAK3基因同时缺失的小鼠模型的制备方法，该方法可操作性强，构建成功率高。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种NOD遗传背景双基因缺陷小鼠模型的制备方法，利用基因编辑技术敲除NOD小鼠的RAG1基因的第2号外显子全部编码区DNA片段以及JAK3基因上包括18-21号外显子序列在内的DNA片段；敲除的后的RAG1基因序列如SEQIDNO:9所示，敲除的后的JAK3基因序列如SEQIDNO:10所示。本专利技术首次在NOD遗传背景小鼠模型中利用CRISPR/Cas9系统实现了对控制小鼠免疫系统的关键基因RAG1与JAK3进行特异性敲除，获得一种在NOD遗传背景下重症联合免疫缺陷表型的小鼠动物模型，该模型小鼠中免疫细胞完全消失。本专利技术敲除了RAG1与JAK3基因的部分份片段，敲除后的RAG1基因序列如SEQIDNO:9所示，敲除后的JAK3基因序列如SEQIDNO:10所示。优选地，所述基因编辑技术为CRISPR-Cas9基因编辑工具。优选地，所述的方法，包括以下步骤：(1)针对NOD小鼠的RAG1基因的第2号外显子设计两端sgRNA识别位点，其识别序列如下：Ragl-5sgRNA-1：TAATAGGTACCAGGGACGTTGGG(SEQIDNO:1)Ragl-5sgRNA-2：CTAATAGGTACCAGGGACGTTGG(SEQIDNO:2)Ragl-3sgRNA-1：CTTGGAGCAGCGGTAGCTGCAGG(SEQIDNO:3)Ragl-3sgRNA-2：AGCGGTAGCTGCAGGGGACCAGG(SEQIDNO:4)；(2)针对NOD小鼠的JAK3基因的第18号至21号外显子设计两端sgRNA识别位点，其识别序列如下：Jak3-17sgRNA-1：CACAGACTGGCGTCACTGCATGG(SEQIDNO:5)Jak3-17sgRNA-2：CGACAAGATGTTCTCATCTGAGG(SEQIDNO:6)Jak3-21sgRNA-1：TTCTAGCTCCGTCCCTCCGCAGG(SEQIDNO:7)Jak3-21sgRNA-2：TCTAGCTCCGTCCCTCCGCAGGG(SEQIDNO:8)；(3)利用体外转录技术获得相应sgRNAmRAN和Cas9mRNA；可利用本领域的CRISPR/Cas9系统试剂盒获得sgRNAmRAN和Cas9mRNA。(4)将sgRNAmRAN和Cas9mRNA共同注射入NOD小鼠受精卵细胞内，然后将所述受精卵移本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NOD遗传背景双基因免疫缺陷小鼠模型的制备方法，其特征在于，利用基因编辑技术敲除NOD小鼠的RAG1基因的第2号外显子全部编码区DNA片段以及JAK3基因上包括18-21号外显子序列在内的DNA片段；敲除的后的RAG1基因序列如SEQ ID NO:9所示，敲除的后的JAK3基因序列如SEQ ID NO:10所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种NOD遗传背景双基因免疫缺陷小鼠模型的制备方法，其特征在于，利用基因编辑技术敲除NOD小鼠的RAG1基因的第2号外显子全部编码区DNA片段以及JAK3基因上包括18-21号外显子序列在内的DNA片段；敲除的后的RAG1基因序列如SEQIDNO:9所示，敲除的后的JAK3基因序列如SEQIDNO:10所示。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基因编辑技术为CRISPR-Cas9基因编辑工具。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对NOD小鼠的RAG1基因的第2号外显子设计两端sgRNA识别位点，其识别序列如下：
Ragl-5sgRNA-1：TAATAGGTACCAGGGACGTTGGG(SEQIDNO:1)
Ragl-5sgRNA-2：CTAATAGGTACCAGGGACGTTGG(SEQIDNO:2)
Ragl-3sgRNA-1：CTTGGAGCAGCGGTAGCTGCAGG(SEQIDNO:3)
Ragl-3sgRNA-2：AGCGGTAGCTGCAGGGGACCAGG(SEQIDNO:4)；
(2)针对NOD小鼠的JAK3基因的第18号至21号外显子设计两端sgRNA识别位点，其识别序列如下：
Jak3-17sgRNA-1：CACAGACTGGCGTCACTGCATGG(SEQIDNO:5)
Jak3-17sgRNA-2：CGACAAGATGTTCTCATCTGAGG(SEQIDNO:6)
Jak3-21sgRNA-1：TTCTAGCTCCGTCCCTCCGCAGG(SEQIDNO:7)
Jak3-21sgRNA-2：TCTAGCTCCGTCCCTCCGCAGGG(SEQIDNO:8)；
(3)利用体外转录技术获得相应sgRNAmRAN和Cas9mRNA；
(4)将sgRNAmRAN和Cas9mRNA共同注射入NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：李贤，
申请(专利权)人：广州欣意生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44