抗CEACAM5纳米抗体制造技术

本发明专利技术提出一种抗CEACAM5纳米抗体。该抗体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中包含4个FR和3个CDR。所述纳米抗体能够特异性靶向人CEACAM5蛋白，具有分子量小、高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性等特点。

【技术实现步骤摘要】
抗CEACAM5纳米抗体
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及纳米抗体及其制备方法和应用，该纳米抗体可应用于CEACAM5蛋白检测试剂及治疗性抗体的研发。
技术介绍
癌胚抗原（CEA）是一种从结肠癌和胎儿肠组织中发现的蛋白，临床上较早用于肿瘤检测的标志物，在正常人的体细胞中CEA的生成量较少，而在恶性肿瘤患者的多种器官中都会有表达，能够用于肿瘤的诊断及鉴别，但是该肿瘤标准物的诊断缺少特异性。CEA很高主要出现在胰腺癌、大肠癌、乳腺癌、胃癌以及小细胞肺癌等多种肿瘤中，CEA在肿瘤患者血清中诊断的灵敏度与肿瘤有无淋巴结、肿瘤的大小以及肿瘤是否发生其他部位的转移有着密切的关系。1993年Hamers-Casterman等在nature上报道了在骆驼血清中大量存在的一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体。单域重链抗体是指仅由重链抗体可变区组成的基因工程抗体，又称为VHH抗体或者纳米抗体（Nb）。与普通抗体相比，骆驼重链抗体除了缺少轻链之外，其重链可变区与铰链区之间没有CH1区。恒定区CH1是与轻链锚定的部位，在纳米抗体的基因组中存在，但在mRNA形成中被剪掉，纳米抗体靠仅有的3个CDRs就具备抗原的特异性和高亲和力，而普通抗体则需要6个CDRs，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。和普通抗体相比，纳米抗体分子量小，结构简单，易于进行基因改造，体积小，抗原特异性好，组织穿透力强，稳定性高，在疾病的诊断及治疗方面有广阔的应用前景。基于此，我们研发了全新的针对CEACAM5的纳米抗体，以期进一步提高抗体的功能。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种针对CEACAM5的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列以及制备方法。本申请的专利技术人采用羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，开发出了靶向CEACAM5的高亲和纳米抗体。一方面，本专利技术提出了一种纳米抗体。根据本专利技术的实施例，所述纳米抗体的氨基酸序列为SEQIDNO：1。根据本专利技术实施例的纳米抗体是特异性靶向CEACAM5蛋白的抗体，能够结合天然构象的CEACAM5蛋白，并且所述纳米抗体具有如下较普通抗体的独特性质:(1)高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力。根据本专利技术的实施例，所述纳米抗体的氨基酸序列为SEQIDNO:1所示，其框架区为SEQIDNO:2所示的FR1，SEQIDNO:4所示的FR2，SEQIDNO:6所示的FR3，SEQIDNO:8所示的FR4；其互补决定区为SEQIDNO:3所示的CDR1，SEQIDNO:5所示的CDR2，SEQIDNO:7所示的CDR3。根据本专利技术实施例的纳米抗体是特异性靶向CEACAM5蛋白的抗体，能够结合天然构象的CEACAM5蛋白，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力。又一方面，本专利技术提出了一种核酸。根据本专利技术的实施例，所述核酸为：编码前面所述纳米抗体的核酸或其互补序列。根据本专利技术实施例的核酸特异性编码前面所述的纳米抗体，所述纳米抗体能够特异性靶向CEACAM5，结合天然构象的CEACAM5，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力。根据本专利技术的实施例，所述核酸具有SEQIDNO：9所示核苷酸序列。根据本专利技术实施例的上述核酸所编码的蛋白具有与CEACAM5显著的高亲和活性，且该蛋白具有典型的纳米抗体的结构，即由框架区(FR1，FR2，FR3和FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。需要说明的是，对于本专利技术权利要求书和说明书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本权利要求书和说明书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。再一方面，本专利技术提供了一种表达载体，其包含上述核酸。又一方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，其包含上述表达载体。有益效果：与传统抗体制备技术相比，本专利技术将羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，充分利用了噬菌体展示技术的优势——(1)较大的库容量，筛选操作简单，通量高；(2)高效率的淘选使得成功挑选微量存在但亲和力高的噬菌体成为可能，并能通过感染细菌而得到富集；(3)可以直接得到抗体基因，便于进一步构建各种基因工程抗体，还可用于一些难于制备的抗体，如弱免疫原、毒性抗原等，以及人源化抗体。所获得纳米抗体，较传统抗体，具有明显的高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力的优势。本专利技术的优点如下：本专利技术将重组CEACAM5蛋白免疫羊驼，随后利用该羊驼外周血淋巴细胞建立了针对于CEACAM5的纳米抗体基因库，试验中将CEACAM5偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（羊驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对CEACAM5特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。附图说明图1显示实施例的免疫后羊驼血清中CEACAM5抗体ELISA检测结果图。图2显示实施例的SDS-PAGE电泳检测CEACAM5纳米抗体的表达结果图。图3显示实施例的纯化的CEACAM5纳米抗体亲和力的ELISA检测结果图。具体实施方式下面通过具体实施例进一步描述本专利技术，但本专利技术不仅限于所述实施例。实施例1构建针对CEACAM5蛋白的纳米抗体文库将重组CEACAM5蛋白与弗氏佐剂混合后免疫羊驼，共免疫4次。4次免疫结束后，提取50mL羊驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；然后通过Nest-PCR技术克隆抗体的VHH区，并将克隆产物通过同源重组的方法插入噬菌体，以获得噬菌体展示库。实施例2亲和淘选以及淘选后的文库扩增(1)亲和淘选1）将重组CEACAM5蛋白用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5μg/mL，按100µL/孔加入酶标孔中，每个靶分子包被8孔，4℃包被过夜；2）弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300µL3%BSA-PBS封闭液，37℃封闭1h；3）PBS洗涤3次，加入100µL噬菌体文库，37℃孵育1h；5）吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；6）加入100µLGly-HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用10μLTris-HCl中和缓冲液中和；7）取10µL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，改变淘选条件，淘选条件如表1：表1亲和淘选条件轮次抗原包被浓度(µg/mL)封闭液文库投入量(cfu)结合时间(h)PBST浓度P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对CEACAM5的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；/n其框架区为SEQ ID NO:2所示的FR1，SEQ ID NO:4所示的FR2，SEQ ID NO:6所示的FR3，SEQ ID NO:8所示的FR4；/n其互补决定区为SEQ ID NO:3所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2，SEQ ID NO:7所示的CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对CEACAM5的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；
其框架区为SEQIDNO:2所示的FR1，SEQIDNO:4所示的FR2，SEQIDNO:6所示的FR3，SEQIDNO:8所示的FR4；
其互补决定区为SEQIDNO:3所示的CDR1，SEQIDNO:5...

【专利技术属性】
技术研发人员：单鸿，李丹，梅超明，杨帆，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：广东;44