一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法及应用。该方法包括以3'

【技术实现步骤摘要】
一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法及应用


[0001]本专利技术涉及分子诊断
，尤其是涉及一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维化/荧光分析方法及其应用。

技术介绍

[0002]目前癌症患者一旦被确诊，基本上都是中晚期，治愈的可能性及5年生存率比较低。因此对于肿瘤的早发现，其检测技术是最为核心的。现有肿瘤医学检测方法有液体活检、影像学、病理学研究等。以上方法中，液体活检在肿瘤的早发现方面是最直接和有效地。活跃生长的肿瘤通常会向外周血中释放循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)。越来越多的证据表明，以CTCs作为液体活检标本，对于早发现、预测复发风险、评估治疗反应和指导治疗方案，实现真正的个体化医疗具有重要意义。CTCs数目是非常稀少的，在良性疾病患者体内和正常人体内没有，在早期癌症患者体内数目稀少，且在整个癌症发展过程中均可被检测到。因此，高灵敏的CTCs检测技术对于早期癌症患者的诊断具有重要意义。
[0003]现有医学检测机构对循环肿瘤细胞(CTCs)检测方法主要是基于叶酸受体(Folate receptor,FR)识别的免疫磁珠富集纯化、靶向探针标记和荧光定量PCR(Polymerase chain reaction)三步方法。免疫磁珠富集纯化的作用是去除红细胞和绝大多数的白细胞，同时富集CTCs。靶向探针标记是使用特异性小分子探针对FR阳性细胞进行标记，用于后续定量。荧光定量PCR是利用特异性引物，结合Taqman探针和PCR技术，对FR特异性结合的小分子探针中的寡聚核苷酸进行定量，评估样品中FR细胞水平。
[0004]然而本申请人发现就靶向探针标记和荧光定量PCR步骤而言存在以下几个问题：1、以FR为标志物，部分细胞(如肺癌细胞)对FR的表达水平较低，造成其检测的覆盖面不全；2、使用叶酸和FR识别对，捕获CTCs以及使用磁珠辅助分离，过程为非均相，操作复杂且耗时，影响检测准确性；3、使用PCR技术，需要蛋白酶且为变温过程，需要成熟的仪器和专业操作人员；4、难以实现即时检验(point
‑
of
‑
care testing，POCT)以及可视化读取；5、成本较高，以华西医院为例单次收费在2000元以上，且仅仅可在大型医院内完成，难以在基层医院推广以及用于患者的自我监测。因此，针对现有技术存在的问题，需要提供一种简化现有肿瘤诊断流程和操作，缩短时间、降低成本且改善分析灵敏度的分析方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，以解决现有技术中对循环肿瘤细胞的检测方法覆盖面不全，难以实现即时检验及可视化读取的技术问题。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光分析方法的应用。
[0007]本专利技术提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下
文阐述。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0009]本专利技术提供的一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，包括以3'
‑
端修饰叶酸的核酸链为识别探针对循环肿瘤细胞表面的生物标志物叶酸受体进行选择性识别结合；
[0010]基于叶酸受体引起的位阻调控使核酸外切酶I选择性识别并切割未结合叶酸受体的叶酸修饰的核酸链，进而通过核酸聚合酶或延伸酶催化延伸被切割的叶酸修饰的核酸链形成核酸链模板，以形成DNA模板Cu NPs或DNA模板Ag NPs；加入QDs选择性识别体系中的Cu
2+
和Cu NPs或者Ag
+
和Ag NPs，以便使体系基于叶酸受体与3'
‑
端修饰叶酸的核酸链的特异性结合而引起对信号分子Cu NPs、Ag NPs或QDs的信号变化进而得到循环肿瘤细胞的分析结果。
[0011]根据一种优选实施方式，所述信号分子为QDs，所述信号分子QDs的信号变化能够通过二维可视化颜色变化检测或荧光信号变化检测而得到。
[0012]根据一种优选实施方式，所述二维可视化颜色变化检测包括紫外灯下读取试管内溶液颜色；以及通过喷墨打印试纸读取试纸上的距离变化对循环肿瘤细胞进行定量分析。
[0013]根据一种优选实施方式，所述试纸上的距离变化包括随循环肿瘤细胞浓度的增加，喷墨打印试纸上的距离变化越长。
[0014]根据一种优选实施方式，所述信号分子为QDs，以QDs为信号分子时能够检测到低至0.03fg/mL浓度的叶酸受体或者低至0.2cells/mL浓度的循环肿瘤细胞。
[0015]根据一种优选实施方式，基于叶酸受体对核酸外切酶I的位阻调控使核酸外切酶I选择性识别并切割未结合叶酸受体的叶酸修饰的核酸链包括使3'
‑
端修饰叶酸的核酸链在与叶酸受体进行特异性结合后抑制核酸外切酶I对其进行识别切割。
[0016]根据一种优选实施方式，其中，还包括通过核酸聚合酶或延伸酶选择性识别延伸3'
‑
端OH的寡核苷酸，以实现循环肿瘤细胞内的生物标志物叶酸受体的特异性识别。
[0017]根据一种优选实施方式，所述核酸聚合酶或延伸酶包括TdT酶。
[0018]本专利技术还提供了一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞均相二维可视化/荧光分析方法的应用，所述应用包括将所述的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞均相二维可视化/荧光分析方法应用于循环肿瘤细胞的检测设备中。
[0019]根据一种优选实施方式，所述检测设备包括检测试剂盒。
[0020]基于上述技术方案，本专利技术的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞均相二维可视化/荧光分析方法至少具有如下技术效果：
[0021]本专利技术的选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法通过以循环肿瘤细胞表面的叶酸受体为生物标志物，以3'
‑
端修饰叶酸的核酸链作为循环肿瘤细胞表面叶酸受体的识别探针，与叶酸受体进行特异性结合；通过在核酸外切酶I和核酸聚合酶或延伸酶的辅助识别和延伸作用下，形成DNA模板Cu NPs或DNA模板Ag NPs，结合QDs的选择性识别特性，分别以Cu NPs、Ag NPs或QDs为信号分子，以便得到由于叶酸受体与叶酸的特异性结合所引起的体系内信号分子的信号变化进而得到循环肿瘤细胞的分析结果。本专利技术的分析方法可实现颜色和距离二维可视化或荧光分析，提高了检测灵敏度和准确性，简化了现有肿瘤诊断流程和操作，缩短了时间，降低了成本，为肿瘤医学诊断提供了
更多选择，为癌症CTCs的多维POCT分析奠定了基础，同时为构建家庭便捷式可视化分析装置提供了理论指导。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，包括以3'
‑
端修饰叶酸的核酸链为识别探针对循环肿瘤细胞表面的生物标志物叶酸受体进行选择性识别结合；基于叶酸受体引起的位阻调控使核酸外切酶I选择性识别并切割未结合叶酸受体的叶酸修饰的核酸链，进而通过核酸聚合酶或延伸酶催化延伸被切割的叶酸修饰的核酸链形成核酸链模板，以形成DNA模板Cu NPs或DNA模板Ag NPs；加入QDs选择性识别体系中的Cu
2+
和Cu NPs或者Ag
+
和Ag NPs，以便使体系基于叶酸受体与3'
‑
端修饰叶酸的核酸链的特异性结合而引起对信号分子Cu NPs、Ag NPs或QDs的信号变化进而得到循环肿瘤细胞的分析结果。2.根据权利要求1所述的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，所述信号分子为QDs，所述信号分子QDs的信号变化能够通过二维可视化颜色变化检测或荧光信号变化检测而得到。3.根据权利要求2所述的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，所述二维可视化颜色变化检测包括紫外灯下读取试管内溶液颜色；以及通过喷墨打印试纸读取试纸上的距离变化对循环肿瘤细胞进行定量分析。4.根据权利要求3所述的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，所述试纸上的距离变化包括随循环...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈飘飘，何雅秦，瞿润连，应斌武，
申请(专利权)人：成都华西精准医学产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：