一种基于表面增强拉曼散射的超灵敏生物芯片及其制备方法技术

一种基于表面增强拉曼散射的SARS

【技术实现步骤摘要】
一种基于表面增强拉曼散射的超灵敏生物芯片及其制备方法


[0001]本专利技术属于功能材料与生物传感检测
，具体涉及一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS
‑
CoV
‑
2超灵敏生物芯片及其制备方法。

技术介绍

[0002]由新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)引起的COVID
‑
19疫情迅速蔓延，在世界各地造成了令人担忧的形势。目前已经证实该病毒可通过呼吸道飞沫、气溶胶和与非生物表面的接触传播，无症状感染和传播已成为重大公共卫生问题。因此，迫切需要开发敏感、快速和低成本的诊断工具来对受感染的个人进行早期筛查，以便能够促进适当的隔离和治疗。
[0003]在临床中，COVID
‑
19的诊断方法主要有三种：(1)胸部CT扫描；(2)基于逆转录酶
‑
聚合酶链反应(RT
‑
qPCR)的核糖核酸(RNA)检测；(3)血清抗体免疫测定。但是胸部CT扫描和抗体检测均不适用于早期和无症状病例的筛查，RT
‑
qPCR方法对实验室环境、检测人员和仪器都有较高的要求。因此，无需标本制备步骤，直接检测病毒抗原的高灵敏度免疫诊断方法是快速、准确诊断COVID
‑
19的必要手段。SARS
‑
CoV
‑
2病毒及其结构蛋白包括刺突(S)糖蛋白、小包膜(E)蛋白、基质(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白以及几种附属蛋白。其中，S蛋白对粘附宿主细胞至关重要，是诊断COVID
‑
19最有价值的抗原生物标志物之一。在现有的众多分析工具中，表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)具有灵敏度高及水干扰小等优点，其独特的指纹特性在生物样品鉴定中具有明显的优势。基于SERS的生物传感器不需要大量的样品制备步骤，为SARS
‑
CoV
‑
2检测提供了一种有效的方法。
[0004]目前，大多数方法都采用传统静电吸附制备的SERS免疫基底检测病毒或肿瘤标志物，但是传统的静电吸附法操作时间长，均匀性差，导致检测误差较大。因此，对于检测灵敏度低、重复性差等问题的解决，将会有效推动SERS技术在生物领域的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于解决利用金属纳米颗粒修饰的SERS免疫基底检测灵敏度低、重复性差等问题，提供一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS
‑
CoV
‑
2超灵敏生物芯片及其制备方法。
[0006]一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS
‑
CoV
‑
2超灵敏生物芯片，其特征在于：以硅片为衬底组装金纳米颗粒，修饰新型冠状病毒刺突蛋白抗体(SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody)和牛血清白蛋白(BSA)得到SERS免疫基底；通过在Ag NPs表面依次修饰拉曼分子对巯基苯甲酸(4MBA)和SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody，制备SERS免疫探针；然后将SERS免疫基底吸附不同浓度的新型冠状病毒刺突蛋白抗原(SARS
‑
CoV
‑
2spike antigen protein)和SERS免疫探针(Ag@4MBA@SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody)，所述免疫基底具有两层致密的金纳米颗粒，所述超灵敏生物芯片具有三明治免疫夹心结构。
[0007]本专利技术所述的金纳米颗粒，标记为Au NPs。
[0008]本专利技术所述的银纳米颗粒，标记为Ag NPs。
[0009]本专利技术所述SESR免疫探针修饰的拉曼分子为对巯基苯甲酸(4MBA)。
[0010]本专利技术所述新型冠状病毒刺突蛋白抗体为SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody。
[0011]本专利技术所述新型冠状病毒刺突蛋白抗原为SARS
‑
CoV
‑
2spike protein。
[0012]金和银纳米颗粒是我们按已知方法合成的，SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody、SARS
‑
CoV
‑
2spike protein、4MBA、BSA购买得到。
[0013]如果没有特别说明，本专利技术所述的溶液均是水溶液，PBS为磷酸缓冲盐溶液。
[0014]一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS
‑
CoV
‑
2超灵敏生物芯片的制备方法，利用抗体和抗原的特异性吸附功能，其步骤如下：
[0015](1)利用三相液液界面自组装方法在硅片上组装Au NPs，然后修饰SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody作为SERS免疫基底：具体为将1mL Au NPs溶液用去离子水稀释8～15倍，进行第一次离心，然后将沉淀分散到1mL聚乙烯吡咯烷酮溶液(PVP)中，进行第二次离心，再将沉淀分散于1mL乙醇中；随后，在90～150μL Au NPs的乙醇溶液中加入1～1.2mL二氯甲烷和1.8～2mL去离子水，将得到的混合溶液剧烈摇晃30～60s；再缓慢加入400～450μL正己烷，此时在液体表面形成了致密的Au NPs单层膜，用亲水处理后的硅片将Au NPs单层膜捞起；重复上述制备致密的Au NPs单层膜的操作1次，然后用上述硅片再次将致密的Au NPs单层膜捞起，从而在硅片上组装2层Au NPs单层膜，得到SERS活性基底；将SERS活性基底浸入20～25μM的巯基十一酸乙醇溶液(MUA)中1.5～3.0h，取出后用乙醇溶液冲洗2～4次；然后在SERS活性基底上滴加10～15μL、10～12μg/mL SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody的PBS溶液，4℃孵育4～6小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次；最后向上述基底表面滴加10～15μL、质量百分数3～5％的BSA的PBS溶液，4℃孵育1.5～3.0小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次，得到SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody修饰的SERS免疫基底；
[0016](2)通过在Ag NPs表面依次修饰拉曼分子对巯基苯甲酸(4MBA)和SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody，制备SERS免疫探针：具体是将200～300μL、0.1mM4MBA的乙醇溶液加入到1mL Ag NPs溶液中，27～32℃搅拌8～12h，800本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于表面增强拉曼散射的SARS
‑
CoV
‑
2超灵敏生物芯片的制备方法，其步骤如下：(1)将1mL Au NPs溶液用去离子水稀释8～15倍，进行第一次离心，然后将沉淀分散到1mL聚乙烯吡咯烷酮溶液中，进行第二次离心，再将沉淀分散于1mL乙醇中；随后，在90～150μL Au NPs的乙醇溶液中加入1～1.2mL二氯甲烷和1.8～2mL去离子水，将得到的混合溶液剧烈摇晃30～60s；再缓慢加入400～450μL正己烷，此时在液体表面形成了致密的Au NPs单层膜，用亲水处理后的硅片将Au NPs单层膜捞起；重复上述制备致密的Au NPs单层膜的操作1次，然后用上述硅片再次将致密的Au NPs单层膜捞起，从而在硅片上组装2层Au NPs单层膜，从而得到SERS活性基底；将SERS活性基底浸入20～25μM的巯基十一酸乙醇溶液中1.5～3.0h，取出后用乙醇溶液冲洗2～4次；然后在SERS活性基底上滴加10～15μL、10～12μg/mL SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody的PBS溶液，4℃孵育4～6小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次；最后向上述基底表面滴加10～15μL、质量百分数3～5％的BSA的PBS溶液，4℃孵育1.5～3.0小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次，得到SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody修饰的SERS免疫基底；(2)将200～300μL、0.1mM 4MBA的乙醇溶液加入到1mL Ag NPs溶液中，27～32℃搅拌8～12h，8000～9000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中，得到4MBA修饰的Ag NPs溶液，记为Ag@4MBA溶液；再将30～50μL、10～12μg/mL SARS
‑
CoV
‑
2spike antibody的PBS溶液加入到1mL Ag@4MBA溶液中，4℃孵化4～6h，6000～7000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中；最后向上述溶液中加入50～80μL、质量百分数3％～5％的BSA的PBS溶液孵化1.5～3.0小时，6000～7000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中，得到SERS免疫探针溶液；(3)向步骤(1)得到的SERS免疫基底表面滴加10～15μL浓度为1fg/mL～1ng/mL的SARS
‑
CoV
‑
2spike antigen protein的PBS溶液，37℃孵育2～3小时后用PBS和去离子水依次冲洗2～4次；然后滴加15～20μL步骤(2)制备的SERS免疫探针溶液，4℃孵育2～3小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢革宇，刘晓敏，张美玲，潘嘉林，张玲，包浩强，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：