本发明专利技术属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用。包括采样用核酸吸附材料、阳性对照膜片、阴性对照膜片、样品采集管、漂洗管A(红盖)、漂洗管B(蓝盖)、扩增检测管、研磨棒、牙签、滤纸条、说明书。本发明专利技术试剂盒只需要一个保温设备(水浴锅或金属浴或可关闭热盖功能的PCR仪，或者由一个保温杯、一个温度计和薄泡沫板制成简易保温装置)，检测全过程(从核酸提取、扩增至结果判读)为55分钟，检测结果与中国动物疫病预防控制中心批准的荧光PCR类产品无显著差异，且本试剂盒还能同时检测p72、MGF_360‑14L、CD2v三个基因。
【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用
：本专利技术属于病毒检测
，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用。
技术介绍
：非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(AfricanSwinefevervirus，ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起的一种急性、出血性、烈性传染病。自2018年8月初我国发生ASF疫情，扑杀生猪超过100万头，给我国养猪业造成了无法估量的损失。目前，ASF缺乏有效疫苗防制，建立快速、灵敏、特异的诊断方法对ASF的防控至关重要。由于对ASFV检测更简单、更快速的需求，促进了快速检测试剂盒的飞速发展。2019年1月4日，中国动物疫病预防控制中心批准了11家快速检测试剂方法，其中荧光PCR类有8家公司，核酸等温扩增类(LAMP检测试剂盒)有1家公司，试纸条类(主要为抗原检测试纸条)有2家公司。2019到2020年，大规模养殖企业逐步建立了ASFV的荧光PCR实验室快速监测体系。通过检测人员、车辆、物资和环境擦拭物等样本，阻断传染源；通过定期抽检和对异常猪加强巡查和监测，在早期阶段及时发现猪场内的ASFV感染；一旦发现阳性猪，荧光PCR检测快速确定猪群感染率，排查传染源和传播途径。这一套体系可有效控制ASFV野毒感染，将疫情的损失控制在一定范围。然而，ASFV的荧光PCR检测方法需要训练有素的操作人员，且依赖于成本昂贵的检测仪器，限制了其在小规模养殖企业或散户检测的应用。阻碍当前检测方法广泛应用的另一瓶颈是从复杂的生物样品中(如，动物血液、组织、肛拭子等样本)现场快速提取核酸的要求。基于核酸恒温扩增技术(Nucleicacidisothermalamplificationtechnology,NAIAT)的核酸检测方法能够实现快速、简单、高效的扩增，且对仪器依赖性低，非常适用于现场即时检测(Point-of-caretesting,POCT)中，是一种极具应用潜力的核酸分析手段。考虑到当前猪场ASF基因缺失弱毒株的检出率逐渐上升，ASF基因缺失弱毒株在猪场内潜伏感染传播，在感染初期非常难以察觉，一旦发现感染率已经非常高，难以实施拔牙处置，给猪场带来巨大的损失。仅通过常规的ASFVP72荧光定量PCR试剂盒难以在早期发现疫情、对野毒和基因缺失弱毒株进行鉴别诊断，以采取针对性的防控措施。所以急需一种可以在现场快速高灵敏鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂盒。
技术实现思路
：本专利技术要解决的技术问题是无论核酸提取还是荧光PCR检测都存在或是涉及需要外部电源的实验室设备(如荧光PCR检测仪和离心机)、几个小时的测定时间、和训练有素的技术人员，或是提取时间长、需要离心、多个移液转液步骤等问题，不能满足将集中式实验室测试转变为现场养殖环境中普遍存在的核酸检测微型化和实用化的需求。为解决上述问题，本专利技术提供了一种应用于非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，该试剂盒只需要一个保温设备(水浴锅或金属浴或可关闭热盖功能的PCR仪，或者由一个保温杯、一个温度计和薄泡沫板制成简易保温装置)，检测全过程(从核酸提取、扩增至结果判读)为45分钟，检测结果与中国动物疫病预防控制中心批准的荧光PCR类产品无显著差异，且本试剂盒还能同时检测p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因。为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，包括以下组分：表1非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分编号名称数量备注1采样用核酸吸附材料6个2阳性对照膜片1个4至-20℃保存3阴性对照膜片1个4至-20℃保存4样品采集管6个4至-20℃保存5漂洗管A(红盖)6个6漂洗管B(蓝盖)6个7扩增检测管8个8研磨棒6个9牙签1包(30支)10滤纸条4条11说明书1份本专利技术基于Cards,WhatmanTM(GEHealthcare,USA)生产的核酸现场快速提取试剂盒可用于动物血液、组织、肛拭子等样本核酸的现场快速提取，整个过程只需3-5分钟，无需任何设备(中途无需过柱离心、热处理等烦琐步骤)，通过直接从膜片中扩增核酸而消除了对单独的核酸洗脱步骤的需要。另外本专利技术将在此基础上，通过采用石蜡包埋技术和特异性引物设计以改进试剂盒在气溶胶污染和检测灵敏度低等方面存在的问题，研制出简单便携、灵敏特异、低成本、适用于现场检测ASFV的试剂盒。进一步的，所述扩增检测管内预装检测试剂包括p72基因、MGF_360-14L基因和CD2v基因的特异性引物，见表2。表2p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性引物序列本试剂盒具备同时检测B646L基因(p72)、MGF_360-14L基因(位于MGF360-505R基因中间)和CD2v基因的保守区，来鉴定病原体是强毒株、单基因缺失弱毒株还是双基因缺失弱毒株，根据不同的毒株、感染率采取不同的精准清除或者清场方案。进一步的，所述表中样品采集管内预装30～50μl样品裂解液，样品裂解液为SEMP液、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和的混合液，体积比为4:1:4:2；其中，所述SEMP液的组成为1MTris·HCl(pH8.0)、700mMEDTA、10％SDS、巯基乙醇、平衡酚和双蒸水，体积比为1:10:10:1:20:58，pH为8.0。进一步的，所述表中漂洗管A中预装100～500μl95％乙醇；漂洗管B中预装100～500μl70％～80％乙醇。进一步的，所述表中扩增检测管编号分别为“1～6”、“－”和“+”。所述各检测管预装检测试剂由石蜡(熔点为53-58℃)分割为上下两层，下层为10×Bstbuffer、10mMdNTPs、5MBetaine、100mMMgSO4、350mMMnCl2和3.5mMCaclein，上层为Bst2.0DNA聚合酶和ddH2O以及检测p72、MGF_360-14L或CD2v任一基因的特异性引物。进一步地，所述用于检测ASFV三个基因的扩增检测管内预包埋检测试剂体系分别为：Bst2.0DNA聚合酶1.0μL、10×Bstbuffer3.5μL、25mMdNTPs1.96μL、5MBetaine7.64μL、100mMMgSO42.1μL、350mMMnCl20.05μL、3.5mMCaclein0.25μL、ddH2O15.0μL以及相对应的p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性引物包括：40本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，其特征在于包括以下组分：/n
【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，其特征在于包括以下组分：
编号
名称
数量
备注
1
采样用核酸吸附材料
6个
2
阳性对照膜片
1个
4至-20℃保存
3
阴性对照膜片
1个
4至-20℃保存
4
样品采集管
6个
4至-20℃保存
5
漂洗管A(红盖)
6个
6
漂洗管B(蓝盖)
6个
7
扩增检测管
8个
8
研磨棒
6个
9
牙签
1包(30支)
10
滤纸条
4条
11
说明书
1份
。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述扩增检测管内预装检测试剂包括p72基因、MGF_360-14L基因和CD2v基因的特异性引物：
3.如权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述扩增检测管编号分别为“1～6”、“－”和“+”；...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹志，单虎，周士硕，秦志华，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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