一种液基细胞检查用细胞保存液及其制备方法技术

本申请涉及宫颈癌早期筛查的技术领域，具体公开了一种液基细胞检查用细胞保存液及其制备方法。一种液基细胞检查用细胞保存液包括溶质和溶剂，溶剂包括磷酸缓冲盐溶液和细胞形态固定液，溶质包括黏液分解剂、红细胞裂解剂和可抑制CDK1/CyclinB1复合体活化的细胞核形态固定剂；其制备方法为：制备磷酸缓冲盐溶液，将磷酸缓冲盐溶液调节至弱碱性后与细胞形态固定液混合，最后加入黏液分解剂、红细胞裂解剂和细胞核形态固定剂进行混合。本申请公开的细胞保存液可用于LBC技术中的标本细胞的保存和处理，其具有维持细胞核形态结构的完整性并提高细胞核内物质的染色效果的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种液基细胞检查用细胞保存液及其制备方法
本申请涉及宫颈癌早期筛查的
，更具体地说，它涉及一种液基细胞检查用细胞保存液及其制备方法。
技术介绍
宫颈癌是临床妇科较为常见和多发的恶性肿瘤之一，也是导致妇女死亡率增加的重要疾病，其发病率仅次于乳腺癌，我国每年大约近3万人死于宫颈癌，且我国宫颈癌病死患者数量呈逐年上升趋势。可喜的是，宫颈癌是目前唯一病因明确的妇科恶性肿瘤，其与高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染相关，因此宫颈癌的发生和发展均需要一个渐进的演变过程，该演变过程的持续时间可从数年到数十年，这说明早期的宫颈癌的发生与进展是可以得到控制的。对于宫颈癌患者而言，早期筛查与防治具有十分重要的意义，其能有效阻挡宫颈癌的演变，实现预防或及早治疗宫颈癌的效果。目前宫颈癌的早期筛查方法包括巴氏宫颈涂片法和液基细胞学（LBC）技术。巴氏宫颈涂片法是传统的细胞学技术，最早由希腊医师Papanicolaou在1941年提出，巴氏宫颈涂片法是一种操作方便、成本低廉的筛查方法，在过去的几十年时间内，巴氏理论及技术的应用大大降低了宫颈癌的发病率和死亡率。LBC技术开创了现代细胞学筛查技术的先河，其通过改进细胞取样和制片质量提高了宫颈病变的诊断准确性。由于巴氏宫颈涂片技术存在明显的假阴性率，随着现代社会的不断发展，人们对诊断准确性的要求的逐步提高，LBC技术已逐渐取代巴氏宫颈涂片技术成为首选的宫颈癌早筛方法。然而目前LBC技术仍存在诸多问题，一个普遍存在的问题是：制得的涂片上的标本细胞进行染色后的染色效果较差，从而提高了诊断难度与对诊断人员的技术要求。参照图1和图2，目前采用LBC技术制得的涂片上的标本细胞中的细胞核在染色时的染色效果较差，导致染色后的细胞核的颜色相对均匀，细胞核内的染色质无法较清晰地进行展示，使得医师难以分辨病变细胞。针对上述相关技术，专利技术人经过大量研究与实验进行验证后发现，保持细胞原有形态的完整性，特别是细胞核原有形态的完整性，是提高染色效果的关键因素。
技术实现思路
提供以下描述以帮助本领域技术人员理解本专利技术。细胞核是真核细胞中最大的细胞器，高等动物和人类细胞的细胞核主要由核膜、染色质和核仁等组成，普遍认为维持细胞核形态和结构的完整性的关键在于维持核膜的完整性。广义的细胞核膜主要由外层核膜、内层核膜、核孔复合体和核纤层等部分组成。外层核膜与内质网相连，上面锚定着核糖体。在内外层核膜融合的区域内镶嵌着超过60种蛋白组成的孔状复合体。位于内层核膜下方的是核纤层，核纤层是一层类似网状的结构，由核纤层蛋白组成，核纤层蛋白主要包括A型核纤层蛋白（laminA）和B型核纤层蛋白（laminB），A型核纤层蛋白和B型核纤层蛋白通过头尾聚合形成稳定的核骨架，以维持细胞核膜形态并定位核孔复合体。在活细胞内，Aurora家族激酶和CDK1/CyclinB1复合体协同磷酸化核孔复合体Nup98，使核孔复合体Nup98解聚，之后位于细胞质内的CDK1/CyclinB1复合体和PKC家族激酶进入细胞核内并协同磷酸化laminA和laminB，促使核纤层解聚，从而破坏细胞核膜的形态与结构完整性。在细胞死亡后，细胞膜失去半透性，细胞膜内外渗透压失衡，使得细胞膜发生破裂。细胞膜破裂后细胞质内的溶酶体膜将崩解并释放大量蛋白水解酶，核孔复合体蛋白在蛋白水解酶的作用下发生水解解聚。在核孔复合体蛋白解聚后，蛋白水解酶进入细胞核内，laminA和laminB在蛋白水解酶的作用下发生水解，使得核纤层发生解聚，由此细胞核膜的形态与结构的完整性被破坏。薄层细胞检查（TCT）的流程包括：临床医生使用塑料毛刷对患者宫颈外口和宫颈管中的脱落细胞进行采集，然后将细胞涮洗于细胞保存液中，接着实验人员将装有细胞保存液的标本瓶放入TCT制片机中，在过滤膜的高速旋转下将细胞打散、混匀，然后将细胞吸附到过滤膜上，最后将其印在玻片上制作成为直径为2cm，细胞个数在2万左右的薄片。然后立即使用浓度为95%的酒精固定处理，采用巴氏染色法将细胞进行染色。本文中“短链醇”和“短链醛”是指碳链长度不大于16的醇类或醛类物质，包括但不限于甲醛、甲醇、正丙醇、异丙醇、苯酚、苯甲醛、苯乙醇、间二苯酚等。为了提高通过LBC技术制得的涂片上的标本细胞的细胞核原有形态的完整性，以提高标本细胞细胞核的染色效果，进而降低诊断难度，本申请提供一种液基细胞检查用细胞保存液及其制备方法。第一方面，本申请提供一种液基细胞检查用细胞保存液，采用如下的技术方案：一种液基细胞检查用细胞保存液，包括4-10重量份溶质和1750-1850重量份溶剂；其中，所述溶剂包括磷酸缓冲盐溶液和细胞形态固定液，所述磷酸缓冲盐溶液为由质量比为0.24:1.44:8:0.2:1000的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和去离子水组成的标准PBS溶液，所述细胞形态固定液为醇类或醛类，所述磷酸缓冲盐溶液和所述细胞形态固定液的质量比为100：（75-85）；所述溶质包括黏液分解剂、红细胞裂解剂和可抑制CDK1/CyclinB1复合体活化的细胞核形态固定剂，所述黏液分解剂、所述红细胞裂解剂、所述细胞核形态固定剂与所述溶剂的质量比为（2-3）：（0.1-0.2）：（1.9-6.8）：1799.88。根据采样规范，从患者宫颈外口和宫颈管处采集得到的标本细胞应保持有生理活性。当具有生理活性的标本细胞保存于本申请中的细胞保存液内时，磷酸缓冲盐溶液能保持标本细胞细胞膜内外渗透压的稳定性，从而维持细胞膜形态结构的完整性。醇类或醛类细胞形态固定液能维持标本细胞细胞膜的结构稳定性，从而实现固定标本细胞形态的效果，同时标本细胞的细胞膜完整时，细胞质内的溶酶体酶不发生崩解，溶酶体内含有的蛋白水解酶无法进行释放，由此也保护了细胞核膜的完整性。细胞形态固定液可以是芳烃醇或芳烃醛，也可以是烷烃醇或烷烃醛，当然也可以是不饱和醇或不饱和醛，只要能实现固定标本细胞形态的效果均可使用。本领域技术人员应该理解，使用不同的细胞形态固定液实现相同的固定效果时，细胞形态固定液的使用量应根据实际应用进行调整，该用量本领域技术人员可通过有限次的实验得到。黏液分解剂可将标本细胞中黏附的宫颈黏液进行分解，降低标本细胞的聚集度，从而降低涂片上标本细胞的重叠度。黏液分解剂可以是单种化合物，如尿素，如DL-1,4-二硫代苏糖醇；当然也可以是多种化合物的组合，如尿素与DL-1,4-二硫代苏糖醇的组合物。凡具有黏液分解作用的物质，均应落入本申请要求保护的范围内。红细胞裂解剂可将标本细胞中带有的红细胞进行裂解降解，以减少过多的红细胞对具有诊断意义的细胞的影响。红细胞裂解剂可以是具有溶血作用的单种化合物如薯蓣皂苷和卵磷脂酶等，也可以是多种化合物的组合物如皂素、十二烷基硫酸钠的组合物等。凡具有破坏红细胞结构，使红细胞裂解的物质，均应落入本申请要求保护的范围内。细胞核形态固定剂通过抑制CDK1/CyclinB1复合体活化以抑制核孔复合体和核纤层的解聚，从而维持标本细胞细胞核膜形态结构的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液基细胞检查用细胞保存液，其特征在于，包括4-10重量份溶质和1750-1850重量份溶剂；/n其中，所述溶剂包括磷酸缓冲盐溶液和细胞形态固定液，所述磷酸缓冲盐溶液为由质量比为0.24:1.44:8:0.2:1000的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和去离子水组成的标准PBS溶液，所述细胞形态固定液为醇类或醛类，所述磷酸缓冲盐溶液和所述细胞形态固定液的质量比为100：（75-85）；/n所述溶质包括黏液分解剂、红细胞裂解剂和可抑制CDK1/CyclinB1复合体活化的细胞核形态固定剂，所述黏液分解剂、所述红细胞裂解剂、所述细胞核形态固定剂与所述溶剂的质量比为（2-3）：（0.1-0.2）：（1.9-6.8）：1799.88。/n

【技术特征摘要】
1.一种液基细胞检查用细胞保存液，其特征在于，包括4-10重量份溶质和1750-1850重量份溶剂；
其中，所述溶剂包括磷酸缓冲盐溶液和细胞形态固定液，所述磷酸缓冲盐溶液为由质量比为0.24:1.44:8:0.2:1000的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和去离子水组成的标准PBS溶液，所述细胞形态固定液为醇类或醛类，所述磷酸缓冲盐溶液和所述细胞形态固定液的质量比为100：（75-85）；
所述溶质包括黏液分解剂、红细胞裂解剂和可抑制CDK1/CyclinB1复合体活化的细胞核形态固定剂，所述黏液分解剂、所述红细胞裂解剂、所述细胞核形态固定剂与所述溶剂的质量比为（2-3）：（0.1-0.2）：（1.9-6.8）：1799.88。


2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于：所述细胞核形态固定剂为可从天然植物中提取的活性生物碱，所述细胞核形态固定剂与所述溶剂的质量比为（1.9-2.7）：1799.88。


3.根据权利要求2所述的细胞保存液，其特征在于：所述细胞核形态固定剂为白屈菜碱，所述细胞核形态固定剂与所述溶剂的质量比为（2.2-2.4）：1799.88。


4.根据权利要求3所述的细胞保存液，其特征在于：所述细胞形态固定液为短链醇或短链醛，所述磷酸缓冲盐溶液和所述细胞形态固定液的质量比为100：（78-80）。


5.根据权利要求4所述的细胞保存液，其特征在于：所述细胞形态固定液为乙醇，所述磷酸缓冲盐溶液和所述细胞形态固定液的质量比为100.988：79。


6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏炜，
申请(专利权)人：北京诚智光辉科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11