一种高通量筛选ACE抑制肽的方法技术

本发明专利技术提供了一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，涉及生物肽的制备筛选技术领域。本发明专利技术所述方法包括如下步骤：1)蛋白水解物的制备；2)水解物的最佳筛选浓度确定；3)生物亲和超滤；4)肽组成高通量鉴定及以结合能为指标的分子对接二次筛选。本发明专利技术将生物亲和超滤结合高通量鉴定技术联用，极大提高筛选效率；所述方法基于小分子配体与酶相互作用的生物亲和性，最大化提升筛选的准确性。本发明专利技术所述方法在整个筛选过程中酶和样品的消耗量极大减少，并且以结合能为指标的分子对接模拟筛选可以预测肽的ACE抑制活性，分析肽和ACE的结合位点。本发明专利技术所述方法具有筛选效率高，耗时短且准确性高的优点，可广泛应用于ACE抑制肽的筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选ACE抑制肽的方法
本专利技术属于生物肽的制备筛选
，具体涉及一种高通量筛选ACE抑制肽的方法。
技术介绍
高血压是以动脉收缩压或舒张压升高为特征的一种临床综合症，是导致心血管疾病(动脉硬化、中风和心肌梗塞)和终末期肾病的危险因素，在全球范围内，高血压以12.8％的死亡率高居榜首。血管紧张素转换酶在维持机体血压稳定发挥着重要的作用，它通过水解无活性的十肽AngⅠ成血管收缩活性物质AngⅡ和灭活缓激肽的双重功能，造成血压升高。抑制血管紧张素转换酶活性可有效降低血压，目前临床使用的血管紧张素转换酶抑制剂包括卡托普利、赖诺普利、西罗普利等，尽管这些药物具有明显的降压效果，但也会产生不同程度的副作用，如咳嗽、味觉功能紊乱、皮疹以及白细胞减少等。食源性ACE抑制肽的作用温和、无副作用，容易被机体吸收，且仅对高血压患者产生作用对正常人群血压无影响，这与化学合成类降压药形成了鲜明相比。目前ACE抑制肽大多是通过水解蛋白获得，但蛋白质水解物的组成复杂，分子量分布也很广泛。从复杂蛋白水解物中筛选得到ACE抑制肽的步骤包括水解物的制备、以ACE抑制活性为导向的分离、纯化和肽序列的鉴定。而这些传统的分离和纯化过程既费时又费力。如何高效筛选得到高活性的ACE抑制肽成为亟待解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，基于小分子配体与酶的相互作用的生物亲和性，通过超滤结合液相色谱-质谱联用技术实现ACE抑制肽的高通量筛选，以提升筛选效率和准确性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，包括以下步骤：(1)酶解蛋白后脱盐冻干，得蛋白水解物；(2)将所述蛋白水解物配制成不同浓度的溶液后，测定ACE抑制活性，以ACE抑制率超过90％的水解物浓度为最佳浓度；(3)将ACE与最佳浓度的蛋白水解物溶液共同孵育，在所述孵育后超滤离心，利用乙腈对所述离心的截留物进行洗脱，收集洗脱液后干燥，得多肽；(4)对所述多肽进行高通量鉴定，选择和活性ACE结合的多肽进行分子对接模拟，按照结合能从小到大排列，合成结合能小的肽，合成比例为50％，得所述ACE抑制肽。优选的，步骤(2)所述测定ACE抑制活性的方法包括：将活化的蛋白水解物溶液与活化的ACE溶液混合反应5min，再与活化的HHL溶液混合后反应1h，终止反应，利用HPLC法分析ACE抑制活性。优选的，所述活化的蛋白水解物溶液、活化的ACE溶液和活化的HHL溶液的体积比为1：2：3；所述活化的ACE溶液中ACE的浓度为100mU/mL；所述活化的HHL溶液中HHL的浓度为2.5mmol/L。优选的，所述活化包括分别将蛋白水解物溶液、ACE溶液和HHL溶液在37℃孵育1h。优选的，所述HPLC法的条件包括：SB-C18分析型色谱柱；检测波长：228nm；流速0.8mL/min；流动相A：体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；流动相C：乙腈；进样量：5μL；洗脱条件：流动相C和流动相A的体积比为18:82；用超纯水做空白实验；ACE抑制率＝(空白对照的峰面积-样品的峰面积)/空白对照的峰面积×100％，式I。优选的，步骤(3)所述孵育的温度为37℃，所述孵育的时间为1h。优选的，步骤(3)所述超滤离心时，以灭活的ACE做对照，包括：利用分子量为10kDa的超滤离心管，超滤离心3次，移除滤液后利用体积百分含量为70％的乙腈溶液重悬，再次孵育后离心，分别收集结合活性ACE和结合灭活ACE的两种多肽样品；所述超滤离心和离心的转速均为4000rpm，时间均为20min。优选的，步骤(4)所述高通量鉴定的方法包括：色谱条件为：色谱柱，AcclaimRPepMapRSLC；流动相A：体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；流动相B：体积百分含量为0.1％的甲酸乙腈溶液；流速为220nL/min；梯度洗脱条件包括：0～2min，4～12％流动相B；2～25min，12～22％流动相B；25～32min，22～32％流动相B；32～37min，32～75％流动相B；37～40min，75％流动相B；采用正离子扫描模式，质谱数据采集通过Xcalibur2.2SP1软件操作，质量范围为250～1250m/z，分辨率为70000，根据一级质谱信号强度选择排名前20的多肽进行碎裂，碎裂模式为HCD，能量为27％；母离子图谱用Xcalibur软件分析，同时采用PEAKSStudio7.0软件进行Denovo测序得到多肽氨基酸序列；分别对比结合活性ACE和结合灭活ACE的两种样品的差异性，选择结合活性ACE的样品中特有的肽为具有潜在ACE抑制活性的肽。优选的，步骤(4)所述分子对接模拟的参数包括：盒子中心坐标为：X＝40.607，Y＝32.451，Z＝43.579，盒子大小为：网格间距对接次数为100次，肽段中可旋转键不超过32个。优选的，步骤(4)得到所述ACE抑制肽后，还包括在体外测定所述ACE抑制肽的抑制活性。本专利技术提供了一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，将生物亲和超滤结合高通量鉴定技术联用，极大提高筛选效率；所述方法基于小分子配体与酶的相互作用的生物亲和性，最大化提升筛选的准确性。本专利技术所述方法在整个筛选过程中酶和样品的消耗量极大减少，并且以结合能为指标的分子对接模拟筛选可以预测肽的ACE抑制活性，分析肽和ACE的结合位点。本专利技术所述方法具有筛选效率高，耗时短且准确性高的优点，可广泛应用于ACE抑制肽的筛选。附图说明图1为本专利技术高通量筛选ACE抑制肽的流程图；图2为本专利技术实施例1筛选过程中各成分的性质图，其中，图2A：不同浓度水解物的ACE抑制率；图2B：浓度为0.4mg/mL的BPAA、BPIA、和水解物的ACE抑制率；图2C：BPAA的总离子流图；图2D：BPIA的总离子流图；图2E：LPGPGP在14.32min的全质谱扫描图；图2F：EYFR在14.32min的全质谱扫描图；图2G：LPGPGP在12.25min的全质谱扫描图；图2H：EYFR在12.25min的全质谱扫描图；图3为合成肽的ACE抑制活性。具体实施方式本专利技术提供了一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，流程图如图1所示，包括以下步骤：(1)酶解蛋白后脱盐冻干，得蛋白水解物；(2)将所述蛋白水解物配制成不同浓度的溶液后，测定ACE抑制活性，以ACE抑制率超过90％的水解物浓度为最佳浓度；(3)将ACE与最佳浓度的蛋白水解物溶液共同孵育，在所述孵育后超滤离心，利用乙腈对所述离心的截留物进行洗脱，收集洗脱液后干燥，得多肽；(4)对所述多肽进行高通量鉴定，选择和活性ACE结合的多肽进行分子对接模拟，按照结合能从小到大排列，合成结合能小的肽，合成比例为50％，得所述ACE抑制肽。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)酶解蛋白后脱盐冻干，得蛋白水解物；/n(2)将所述蛋白水解物配制成不同浓度的溶液后，测定ACE抑制活性，以ACE抑制率超过90％的水解物浓度为最佳浓度；/n(3)将ACE与最佳浓度的蛋白水解物溶液共同孵育，在所述孵育后超滤离心，利用乙腈对所述离心的截留物进行洗脱，收集洗脱液后干燥，得多肽；/n(4)对所述多肽进行高通量鉴定，选择和活性ACE结合的多肽进行分子对接模拟，按照结合能从小到大排列，合成结合能小的肽，合成比例为50％，得所述ACE抑制肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)酶解蛋白后脱盐冻干，得蛋白水解物；
(2)将所述蛋白水解物配制成不同浓度的溶液后，测定ACE抑制活性，以ACE抑制率超过90％的水解物浓度为最佳浓度；
(3)将ACE与最佳浓度的蛋白水解物溶液共同孵育，在所述孵育后超滤离心，利用乙腈对所述离心的截留物进行洗脱，收集洗脱液后干燥，得多肽；
(4)对所述多肽进行高通量鉴定，选择和活性ACE结合的多肽进行分子对接模拟，按照结合能从小到大排列，合成结合能小的肽，合成比例为50％，得所述ACE抑制肽。


2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述测定ACE抑制活性的方法包括：将活化的蛋白水解物溶液与活化的ACE溶液混合反应5min，再与活化的HHL溶液混合后反应1h，终止反应，利用HPLC法分析ACE抑制活性。


3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述活化的蛋白水解物溶液、活化的ACE溶液和活化的HHL溶液的体积比为1：2：3；所述活化的ACE溶液中ACE的浓度为100mU/mL；所述活化的HHL溶液中HHL的浓度为2.5mmol/L。


4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述活化包括分别将蛋白水解物溶液、ACE溶液和HHL溶液在37℃孵育1h。


5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述HPLC法的条件包括：SB-C18分析型色谱柱；检测波长：228nm；流速0.8mL/min；流动相A：体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；流动相C：乙腈；进样量：5μL；洗脱条件：流动相C和流动相A的体积比为18:82；用超纯水做空白实验；
ACE抑制率＝(空白对照的峰面积-样品的峰面积)/空白对照的峰面积×100％，式I。


6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育的温度为37℃，所述孵育的时间为1h。

【专利技术属性】
技术研发人员：涂宗财，马天新，张露，李金林，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西;36