一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法技术

本发明专利技术公开了一种荷斯坦牛乳外泌体的分离及鉴定方法，包括荷斯坦牛乳样品的收集，密度梯度离心分离外泌体，对外泌体分别进行透射电镜、粒径分析以及特异性蛋白表达鉴定。本发明专利技术所描述的荷斯坦牛乳外泌体的提取和鉴定方法价格低、效率高且纯度良好，可满足多种试验需求。

【技术实现步骤摘要】
一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法
本专利技术涉及一种外泌体分离及鉴定的方法，具体为一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法，属于农业养殖应用领域。
技术介绍
外泌体（Exosomes）是细胞分泌的直径约为30～150nm，密度为1.13-1.19g/mL的脂质双分子层结构膜性囊泡，呈圆形或椭圆形，具有典型的“杯盘”形态。外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液、羊水和乳汁。外泌体可携带蛋白质、脂质、DNA和RNA(包括mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA)及其降解片段等多种具有生物学活性的物质，其作为新型的细胞间通讯分子，不仅参与细胞间正常的信息传递和物质交换等生物学进程，而且在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症等疑难杂症的治疗方面已崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。有研究发现，牛乳汁中的Exosomes包含众多小RNA（miRNA、lncRNA、circRNA），可转运进入免疫细胞，影响小牛胃肠道和免疫系统发育；同时牛乳中Exosomes还可以携带药物到肿瘤靶点，从而提高药物作用效率和安全性。可见，牛乳中外泌体功能越来越受到重视，亟需进一步研究。因此，探索一种价格低、效率高且纯度良好的牛乳Exosomes提取和鉴定方法是科研和疾病治疗的重要前提。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的，一种荷斯坦牛乳外泌体分离的方法，包括荷斯坦牛乳样本采集和密度梯度超速离心分离外泌体，具体包括以下步骤：A荷斯坦牛乳样本采集挑选健康且处于泌乳期的荷斯坦牛，收集30mL乳汁，将收集的荷斯坦牛乳汁保存于4℃低温冰箱备用；B荷斯坦牛乳外泌体分离（1）取A中新鲜采集的荷斯坦牛乳汁于2,000×g、4℃条件下低温离心30min，收集上层乳汁，弃下层沉淀；（2）将离心后的上层乳汁转移至新的无菌50mL尖底离心管中，于10,000×g、4℃条件下低温离心45min，收集上层乳汁，弃下层沉淀；（3）将步骤（2）中离心后的上层乳汁转移至新的离心管中，选择超速转子，在4℃、100,000×g条件下超速离心120min，弃上层液体，所得下层沉淀为初步分离的荷斯坦牛乳汁外泌体；（4）向步骤（3）中所获的沉淀中加入20mL4℃预冷的1×PBS，重悬沉淀，再次4℃、2,000×g离心30min，弃沉淀；（5）将步骤（4）中离心后的上清转移至新的尖底离心管中，4℃、2,000×g离心30min，弃沉淀；（6）重复步骤（5）1次；（7）将步骤（6）中离心后的上清转移至新的离心管中，选择超速转子，4℃、100,000×g条件下超速离心120min，去除上清，保留下层沉淀；（8）将（7）所获的沉淀重悬于1mL预冷的PBS中，4℃低温保存；（9）分别配制40%、20%、10%和5%的碘克沙醇，各取3.6mL依次加入到超离管中，最后将步骤（8）中的1mL重悬液缓慢加在最上层，4℃，100,000×g，超速离心120min；（10）离心后的混合液分成12层，收集中间6～9层的液体，再次4℃，100,000×g，超速离心120min，去除上清，得到提纯后的牛乳外泌体；（11）将步骤（10）所获外泌体，重悬于100μL预冷的PBS中，立即使用或冻存于-80℃超低温冰箱。优选地，所述用于新鲜牛乳保存和上述步骤（8）中低温冰箱型号为美的BCD-525WKPZM(E)，上述步骤（11）中超低温冰箱型号为EppendorfCryoCubeF570，上述步骤（1）（2）（4）（5）（6）中低温离心机型号为Eppendorf5810R，上述步骤（3）（7）（9）（10）中低温超速离心机型号为BeckmanOptimaL-100XP。一种荷斯坦牛乳外泌体鉴定的方法，包括透射电镜观察鉴定、粒径分析鉴定和Westernblot分析鉴定，具体包括以下步骤：A荷斯坦牛乳外泌体的透射电镜（TEM）观察鉴定（1）取10μL上述分离的外泌体+PBS混合液，滴加于100目的铜网上，静置1min，滤纸吸走浮液；（2）在上述步骤（1）的铜网上，再次滴加10μL磷钨酸，静置1min，滤纸吸走浮液；（3）常温干燥10min；（4）电压选择100kv进行透射电镜成像检测并拍照保存；B荷斯坦牛乳外泌体的粒径分析（NTA）鉴定（1）取10μL上述分离的外泌体+PBS混合液，加入1.9mL的1×PBS，稀释至工作浓度悬液；（2）将步骤（1）中混合液转移至流式管中，通过纳米流式粒径分析仪实时地对悬液中外泌体和囊泡进行逐个成像和观察，并通过Zetaview8.04.02软件计算出悬液中外泌体的粒径分布和浓度；C荷斯坦牛乳样品标志性蛋白免疫印迹（Westernblot）分析鉴定（1）外泌体蛋白样品制备：将冻存于-80℃超低温冰箱的外泌体取出，冰上解冻后，加入100μLRIAP蛋白裂解液，冰上裂解30min；（2）将（1）中的裂解混合物于低温离心机4℃、12,000×g离心15min，取上清，弃沉淀；（3）利用BCA蛋白浓度试剂盒制作标准曲线和检测外泌体蛋白浓度，方法概述如下：分别将20μL浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的蛋白标准品和20μL（2）中的上清液加入96孔板中，每组三次重复；配置并加入BCA工作液（A液：B液=50:1）至上述孔中，振荡混匀，37℃恒温箱孵育30min；利用全波长酶标仪测定A562的吸光度；利用不同浓度的蛋白标准品测得的吸光度，Excel绘制标准曲线，获得回归公式，并带入外泌体蛋白吸光值到以上公式，计算出外泌体蛋白浓度；（4）变性：取40μL裂解后的混合液与10μL的5☓SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀后，100℃煮沸5min，获取变性蛋白；（5）上样、电泳和转膜：打开购置的商品化12%预制胶，插入电泳槽，加满电泳缓冲液，将变性后的20μL蛋白样品加入电泳孔中，进行电泳；电泳完毕后取出电泳胶，浸泡于甲醇中活化10s，然后置于预冷的转膜缓冲液中，在垫子上依次垫海绵、三层滤纸、电泳胶，将膜盖于电泳胶上，在膜上盖三张滤纸并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫，插入转膜槽中，打开电源，90V、60min恒压转膜；（6）封闭：将转好的膜置于室温脱色摇床上，浸入5%的脱脂牛奶，封闭1h；（7）一抗：将Calnexin、CD63、CD81及TSG101一抗浓储液和5%的脱脂牛奶按1:2000稀释后，4ºC孵育膜过夜；（8）二抗：用1☓TBST在室温脱色摇床上将膜洗涤3次，每次5min，将二抗用1☓TBS按1：5000稀释，室温下孵育60min后，1☓TBST洗涤3次，每次5min；（9）曝光：取出PVDF膜，沥干水分，蛋白面朝上平铺于保鲜膜上，将等体积混本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荷斯坦牛乳外泌体分离的方法，其特征在于，包括荷斯坦牛乳样本采集和密度梯度超速离心分离外泌体，具体包括以下步骤：/nA 荷斯坦牛乳样本采集/n挑选健康且处于泌乳期的荷斯坦牛，收集30mL乳汁，将收集的荷斯坦牛乳汁保存于4℃低温冰箱，备用；/nB 荷斯坦牛乳外泌体分离/n（1）取A中新鲜采集的荷斯坦牛乳汁于2,000×g、4℃条件下低温离心30min，收集上层乳汁，弃下层沉淀；/n（2）将离心后的上层乳汁转移至新的无菌50mL尖底离心管中，于10,000×g、4℃条件下低温离心45min，收集上层乳汁，弃下层沉淀；/n（3）将步骤（2）中离心后的上层乳汁转移至新的离心管中，选择超速转子，在4℃、100,000×g条件下超速离心120min，弃上层液体，保留沉淀；/n（4）向步骤（3）中所获的沉淀中加入20mL 4℃预冷的1×PBS，重悬沉淀，再次4℃、2,000×g离心30min，弃沉淀；/n（5）将步骤（4）中离心后的上清转移至新的离心管中，4℃、2,000×g离心30min，弃沉淀；/n（6）重复步骤（5）1次；/n（7）将步骤（6）中离心后的上清转移至新的离心管中，选择超速转子，4℃、100,000×g条件下超速离心120min，去除上清，保留下层沉淀；/n（8）将（7）所获的沉淀重悬于1mL预冷的PBS中，4℃低温保存；/n（9）分别配制40%、20%、10%和5%的碘克沙醇，各取3.6 mL依次加入超离管中，最后将步骤（8）中的1mL 重悬液缓慢加在最上层，4℃，100,000 ×g，超速离心120min；/n（10）离心后溶液分成12层，收集中间6～9层的液体，再次4℃， 100,000×g，超速离心120min，去除上清，得到提纯后的牛乳外泌体；/n（11）将步骤（10）所获外泌体，重悬于100μL预冷的PBS中，立即使用或冻存于-80℃超低温冰箱。/n...

【技术特征摘要】
1.一种荷斯坦牛乳外泌体分离的方法，其特征在于，包括荷斯坦牛乳样本采集和密度梯度超速离心分离外泌体，具体包括以下步骤：
A荷斯坦牛乳样本采集
挑选健康且处于泌乳期的荷斯坦牛，收集30mL乳汁，将收集的荷斯坦牛乳汁保存于4℃低温冰箱，备用；
B荷斯坦牛乳外泌体分离
（1）取A中新鲜采集的荷斯坦牛乳汁于2,000×g、4℃条件下低温离心30min，收集上层乳汁，弃下层沉淀；
（2）将离心后的上层乳汁转移至新的无菌50mL尖底离心管中，于10,000×g、4℃条件下低温离心45min，收集上层乳汁，弃下层沉淀；
（3）将步骤（2）中离心后的上层乳汁转移至新的离心管中，选择超速转子，在4℃、100,000×g条件下超速离心120min，弃上层液体，保留沉淀；
（4）向步骤（3）中所获的沉淀中加入20mL4℃预冷的1×PBS，重悬沉淀，再次4℃、2,000×g离心30min，弃沉淀；
（5）将步骤（4）中离心后的上清转移至新的离心管中，4℃、2,000×g离心30min，弃沉淀；
（6）重复步骤（5）1次；
（7）将步骤（6）中离心后的上清转移至新的离心管中，选择超速转子，4℃、100,000×g条件下超速离心120min，去除上清，保留下层沉淀；
（8）将（7）所获的沉淀重悬于1mL预冷的PBS中，4℃低温保存；
（9）分别配制40%、20%、10%和5%的碘克沙醇，各取3.6mL依次加入超离管中，最后将步骤（8）中的1mL重悬液缓慢加在最上层，4℃，100,000×g，超速离心120min；
（10）离心后溶液分成12层，收集中间6～9层的液体，再次4℃，100,000×g，超速离心120min，去除上清，得到提纯后的牛乳外泌体；
（11）将步骤（10）所获外泌体，重悬于100μL预冷的PBS中，立即使用或冻存于-80℃超低温冰箱。


2.根据权利要求1所述的一种荷斯坦牛乳外泌体分离的方法，其特征在于，所述用于新鲜牛乳保存和所述步骤（8）中低温冰箱型号为美的BCD-525WKPZM(E)，所述步骤（11）中超低温冰箱型号为EppendorfCryoCubeF570，所述步骤（1）（2）（4）（5）（6）中低温离心机型号为Eppendorf5810R，所述步骤（3）（7）（9）（10）中低温超速离心机型号为BeckmanOptimaL-100XP。


3.一种荷斯坦牛乳外泌体鉴定的方法，其特征在于，包括透射电镜观察鉴定、粒径分析鉴定和Westernblot分析鉴定，具体包括以下步骤：
A荷斯坦牛乳外泌体的透射电镜（TEM）观察鉴定
（1）取10μL权利要求1中分离的外泌体+PBS混合液，滴加于100目的铜网上，静置1min，滤纸吸走浮液；
（2）在上述步骤（1）的铜网上，再次滴加10μL磷钨酸，静置1min，滤纸吸走浮液；
（3）常温干燥10min；
（4）电压选择100kv进行透射电镜成像检测并拍照保存；
B荷斯坦牛乳外泌体的粒径分析（NTA）鉴定
（1）取10μL上述分离的外泌体+PBS混合液，加入1.9mL的1×PBS，稀释至工作浓度悬液；
（2）将（1）转移至流式管中，通过纳米流式粒径分析仪实时地对悬液中外泌体和囊泡进行逐个成像和观察，并通过Zetaview8.04.02软件计算出悬液中外泌体的粒径分布和浓度；
C荷斯坦牛乳样品标志性蛋白免疫印迹（Westernblot）分析鉴定
（1）外泌体蛋白样品制备：将冻存于-80℃超低温冰箱的外泌体取出，冰上解冻后...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈坤琳，王悦，王慧利，赵芳，钱勇，丁强，夏淑雯，仲跻峰，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32