一种快速提取高质量DNA的试剂及方法技术

本发明专利技术公开了一种快速提取高质量DNA的试剂及方法，所述试剂包括：1)提取缓冲液：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mM、pH8.0Tris

【技术实现步骤摘要】
一种快速提取高质量DNA的试剂及方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，涉及一种快速提取高质量DNA的试剂及方法。

技术介绍

[0002]红曲霉(Monascus spp.)，其是广泛应用于东南亚地区的一种传统的食用和药用微生物。由于红曲霉能分泌产生天然色素、莫那可林类(monaeolins)物质、氨基丁酸(GABA)等多种有益的次级代谢产物，被广泛用于食品着色剂、食品发酵剂和保健食品的生产。尤其是近年来天然色素能够代替肉制品工业及腐乳生产中的发色剂，安全性高，由此带来的巨大应用前景，引起科学家们的广泛关注。但是在红曲霉的发酵过程中，一种真菌毒素
‑
桔霉素常常伴随产生，这成为红曲霉产品在食品及其他行业广泛应用的瓶颈之一。迄今为止，有关红曲霉次级代谢途径的分子生物学信息少之甚少，因此通过红曲霉的全基因组测序工程全面了解和研究红曲霉的次级代谢途径及其调控机制是非常必要的。
[0003]但是由于红曲霉发酵产生色素及其他次级代谢产物，这严重的阻碍了人们从其菌丝体中提取出高浓度、高纯度的基因组DNA用于全基因组测序。目前已有许多公开发表的适用于真菌基因组DNA的提取方法及专业提取试剂盒，但是利用这些方法提取得到的DNA无论从浓度还是纯度方面都无法满足第二代DNA测序平台的要求，而且这些传统的提取方法，繁琐复杂、成本较高、提取时间长，因此迫切要求发展简便、快速、高效的基因组DNA提取技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种快速提取高质量DNA的试剂及方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过提取试剂及其步骤的优化，可以从富含色素及多糖的真菌中快速提取高质量基因组DNA，该方法在相对较短的时间提取出高浓度、高纯度的基因组DNA，技术简便，高效经济。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术一种快速提取高质量DNA的试剂，包括：
[0007]1)提取缓冲液，其包括：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mM、pH8.0 Tris
‑
HCl，20mM、pH8.0乙二胺四乙酸，1.4M NaCl和2％β
‑
巯基乙醇；
[0008]2)终浓度为3.5mg/mL的RNA水解酶A；
[0009]3)抽提剂，包括酚、氯仿和异戊醇的混合液，所述混合液中酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1。
[0010]本专利技术还提供一种快速提取高质量DNA的方法，包括利用所述的试剂提取真菌中DNA的步骤。
[0011]优选的是，具体包括以下步骤：
[0012]步骤1：收集真菌菌丝体，并进行预处理后，在液氮环境中研磨成粉末；
[0013]步骤2：将粉末加入预热的提取缓冲液中，混合均匀，再于65℃水浴保温20
‑
30min，期间每隔5
‑
10min颠倒混匀一次；所述提取缓冲液包括：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mM、
pH8.0 Tris
‑
HCl，20mM、pH8.0乙二胺四乙酸，1.4M NaCl和2％β
‑
巯基乙醇；
[0014]步骤3：步骤2反应液冷却至室温后，加入等体积抽提剂进行抽提，混合均匀，之后再离心，弃沉淀取上清液；所述抽提剂为酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1的混合液；
[0015]步骤4：向步骤3所得上清液中加入终浓度为3.5mg/mL的RNA水解酶A，高温消化以去除RNA；
[0016]步骤5：冷却至室温后，向步骤4反应液中加入等体积的所述抽提剂，重新抽提、离心，弃沉淀取上清液；
[0017]步骤6：向步骤5所得上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，混合均匀再离心，弃沉淀取上清；
[0018]步骤7：向步骤6所得上清液中加入预冷的异丙醇，混合均匀，
‑
20℃条件下放置20
‑
30min，沉淀DNA；再离心，弃上清液取沉淀；
[0019]步骤8：用75％乙醇洗涤步骤7所述沉淀2
‑
3次，37℃条件下,干燥20
‑
30min后，加无菌水溶解沉淀，
‑
20℃保存。
[0020]优选的是，步骤2中所述粉末和提取缓冲液的质量体积比1
‑
3:10。
[0021]优选的是，步骤3、步骤5、步骤6
‑
7中所述离心条件均为：10000
‑
15000r/min离心10
‑
15min。
[0022]优选的是，步骤4中所述RNA酶消化条件为：65℃水浴30min。
[0023]优选的是，所述氯仿和异戊醇混合液中氯仿:异戊醇体积比为24:1。
[0024]优选的是，步骤7中所述预冷的异丙醇加入体积为上清液中的2/3体积。
[0025]本专利技术公开了以下技术效果：
[0026](1)本专利技术提供的DNA提取方法效率较高，基因组DNA的产量高达173.8
±
1.85ng/μL，片段完整，几乎无降解，并且纯度较好，OD
260
/OD
280
值为1.92
±
0.07，表明无杂蛋白及RNA污染，质量高于专业提取试剂盒，完全能够满足全基因组测序等一系列精密的分子生物学实验；
[0027](2)本专利技术提供的DNA提取方法，相比市售专业提取试剂盒，成本较低，并且实验过程中的所需试剂均为常规试剂，不需要低温离心等实验条件，一般实验室条件均可满足；
[0028](3)本专利技术还具备操作简便快速，仅需三个小时即可完成全部实验的优势。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1为不同方法提取红曲霉基因组DNA的电泳效果；其中，1.实施例1的DNA提取方法；2.改进氯化苄法；3.蜗牛酶法；4.SDS法；5.试剂盒法；M.λDNA/HindIII+EcoRI分子量标准。
具体实施方式
[0031]现以实施例方式对本专利技术技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本专利技术
的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0032]下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0033]将红曲霉按接菌量10％接入麦芽汁培养基(麦芽汁20g/L，蛋白胨1g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、170r/min暗培养6d。至发酵终点时将发酵液5000r/min离心10min后除去上清液，菌丝体用灭菌的双蒸水洗涤2遍。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速提取高质量DNA的试剂，其特征在于，包括：1)提取缓冲液，其包括：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mM、pH8.0 Tris
‑
HCl，20mM、pH8.0乙二胺四乙酸，1.4M NaCl和2％β
‑
巯基乙醇；2)终浓度为3.5mg/mL的RNA水解酶A；3)抽提剂，包括酚、氯仿和异戊醇的混合液，所述混合液中酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1。2.一种快速提取高质量DNA的方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的试剂提取真菌中DNA的步骤。3.如权利要求2所述的快速提取高质量DNA的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1：收集真菌菌丝体，并进行预处理后，在液氮环境中研磨成粉末；步骤2：将粉末加入预热的提取缓冲液中，混合均匀，再于65℃水浴保温20
‑
30min，期间每隔5
‑
10min颠倒混匀一次；所述提取缓冲液包括：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mM、pH8.0 Tris
‑
HCl，20mM、pH8.0乙二胺四乙酸，1.4M NaCl和2％β
‑
巯基乙醇；步骤3：步骤2反应液冷却至室温后，将等体积抽提剂进行抽提，混合均匀，之后再离心，弃沉淀取上清液；所述抽提剂为酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1的混合液；步骤4：向步骤3所得上清液中加入终浓度为3.5mg/mL的RNA水解酶A，高温消化以去除RNA；步骤5：冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨悦，李大鹏，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：