一种阳离子多糖及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种阳离子多糖及其制备方法与应用，属于非病毒载体制备领域。本发明专利技术述及的阳离子多糖，其化学结构如通式(I)所示，本发明专利技术的阳离子多糖溶解在中性缓冲液中，能够高效负载核酸，可用作基因载体；本发明专利技术的基因载体制作成本低，具有肿瘤细胞靶向性，细胞毒性低，转染外源基因能力强。本发明专利技术的阳离子多糖可作为制备siRNA药物以及基因载体的原料，弥补目前非病毒核酸载体普遍存在的细胞靶向性低、细胞转染率低、细胞毒性大、价格昂贵等问题，具有良好的市场应用前景。市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种阳离子多糖及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及非病毒载体制备与应用领域，具体涉及一种阳离子多糖类及其制备方法以及在制备基因载体中的应用。

技术介绍

[0002]小干扰RNA(siRNA)是指长度为21个碱基左右的双链RNA。siRNA进入细胞后结合到含有AGO蛋白的RNA诱导的沉默蛋白复合物(RISC)中，剔除双链RNA中的正义链并保留单链反义链，进而结合并降解与其序列具有互补性的靶mRNA，产生RNA干扰(RNAi)效应。Thomas Tuschl于2001年发现化学合成的siRNA能够在哺乳动物细胞内引发RNAi，特异性降解靶mRNA，为开发siRNA药物提供了理论基础，掀起了siRNA类药物研发的热潮。目前只有三款siRNA药获得FDA批准进入临床使用。
[0003]作为药物，siRNA具有以下优势：首先，siRNA从mRNA水平降低基因表达，非常适合于无法用小分子药物抑制的蛋白水平的调节(如TTR蛋白)；其次，siRNA药物的序列设计极其简单；再次，siRNA的基因沉默效率非常高，所需的IC50值比反义链寡核苷酸要小100倍以上；最后，siRNA起效快，药效持续时间长。SiRNA进入细胞后，几个小时内就能检测到RNAi活性；一次注射给药后siRNA在体内的基因沉默效应能够持续7天
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10天；由此可见，siRNA类药物具有极大的临床应用价值。
[0004]siRNA作为药物也有一些先天性缺陷，比如：(1)具有免疫原性；(2)稳定性差，很容易受到核糖核酸酶的作用而降解；(3)分子大且带强负电荷，难以进入细胞和组织内。SiRNA的免疫原性可以通过2
′‑
F、2
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O
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Me等化学修饰而克服；结合硫代磷酸等磷酸二酯键上的化学修饰能够较好的提高siRNA的稳定性。采用合适的递送载体，不但能够保护siRNA免受细胞外核酸酶的攻击，还能有效促进siRNA进入细胞并在细胞质内启动RNAi功能。由此可见，高效的递送载体是siRNA药物在临床上应用的必要前提。
[0005]目前使用的siRNA载体，其最大的缺陷是缺乏肿瘤细胞靶向性。获得临床使用批准的三款siRNA药物，均只能靶向肝脏细胞：其中，ONPATTRO通过低密度脂蛋白受体(LDL
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R)进入肝脏细胞内；GIVLAARI和OXLUMO则通过脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)进入肝脏细胞内。市售实验室研究用转染试剂，包括PEI MAX、Lipofectamine 2000以及3000等，均通过破坏细胞膜磷脂层结构进入细胞，而无任何细胞特异性和靶向性，并且细胞毒性大，严重限制其应用范围。
[0006]非病毒载体是利用非病毒的载体材料的物化性质来介导基因的转移。非病毒载体具备无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，且易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中，有着病毒载体不可替代的作用。目前，非病毒载体的研究主要包括改性的天然高分子和合成高分子两大类。改性天然高分子主要是脂质类(如固醇类)、多糖类(如壳聚糖、右旋糖苷和藻酸等)、蛋白质类(如胶原蛋白)以及多肽类的物质。合成高分子主要是一些可以生物降解的(如聚乳酸、及其嵌段或接枝共聚物等)、聚阳离子性的高分子(如聚乙烯亚胺)充当运送载体，分别以微球、囊泡
或胶束等形式包覆DNA，运送到达病理部位后进行释放。目前已经应用于基因治疗的非病毒载体绝大多数是阳离子脂质体，原因可能是促进复合物与负电性的细胞壁结合。与病毒载体相比较，非病毒载体具有毒性低、免疫反应低，而且所携带的基因不整合至宿主细胞基因组等优点，然而，非病毒载体的靶向性低，转染效率不高，药物递送效率低，其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种靶向性高、转染效率和药物递送效率高，且细胞毒性低的多糖类非病毒载体。
[0008]本专利技术的另一目的是提供所述多糖类非病毒载体的制备方法与应用。
[0009]本专利技术述及的多糖类非病毒载体为一种阳离子多糖。
[0010]实现本专利技术上述目的的具体技术方案为：一种阳离子多糖类高分子，其化学结构如通式(I)所示：
[0011][0012]式中R1选自乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸，如：
[0013][0014]R2为：
[0015][0016]X为NH2；
[0017]Y为NH或O；
[0018]m为80％～90％，n为5％～10％，o为2％～10％。
[0019]优选地，本专利技术的阳离子多糖为：
[0020][0021]其中m为80％～90％，n为5％～10％，o为6％～8％。
[0022]本专利技术提供了上述阳离子多糖在制备基因载体中的应用。
[0023]具体地，是将本专利技术的阳离子多糖溶解在pH7.2的PBS，在4℃冰箱内保存。将本专利技术的阳离子多糖溶液与DNA或siRNA溶液按氮磷比(N/P；N，代表阳离子多糖的氨基；P，代表DNA或siRNA的磷酸集团)为4：1至6：1的比例混合，快速搅拌后形成纳米微球。
[0024]本专利技术提供了上述阳离子多糖在制备基因治疗药物中的应用。
[0025]含有上述阳离子多糖的基因载体、试剂或药物属于本专利技术的保护范围。
[0026]本专利技术提供了上述阳离子多糖或含有上述阳离子多糖的基因载体在核酸转染中的应用。优选地，本专利技术提供了上述阳离子多糖或含有该阳离子多糖在小干扰RNA或质粒DNA转染中的应用。所述阳离子多糖中氨基摩尔数与小干扰RNA或质粒DNA分子上的磷酸基的摩尔数之比为≥4。
[0027]本专利技术提供了上述阳离子多糖或含有上述阳离子多糖的基因载体在制备靶向治疗肿瘤药物中的应用。在本专利技术实施例中，证实了上述阳离子多糖能够靶向治疗乳腺癌。
[0028]本专利技术提供了上述阳离子多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0029](1)阳离子多糖I的合成：
[0030]将干燥的凝胶多糖溶于有机溶剂中，在氮气保护下加入三苯基膦、四溴化碳、叠氮化钠，0～35℃下搅拌反应24小时后，加入冷乙醇沉淀，离心收集沉淀后用乙醇洗涤3次，真空干燥得到6
‑
脱氧
‑6‑
叠氮化凝胶多糖，反应方程式为：
[0031][0032]n为80～120；
[0033](2)阳离子多糖II的合成：
[0034]将6
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脱氧
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叠氮化凝胶多糖溶解于有机溶剂中，加入硼氢化钠，在60℃下搅拌反应4小时，加入冷乙醇沉淀，离心收集沉淀后用乙醇洗涤3次，真空干燥得到得到6
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脱氧
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氨基凝胶多糖；反应方程式为：
[0035][0036]其中n为80～120；
[0037](3)化合III的合成：
[0038]将戊酸溶解在pH4.5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阳离子多糖，其特征在于，其化学结构如通式(I)所示：式中R1选自乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸；R2为：X为NH2；Y为NH或O；m为80％～90％，n为5％～10％，o为2％～10％。2.如权利要求1所述的阳离子多糖，其特征在于，其为：m为80％～90％，n为5％～10％，o为6％～8％。3.权利要求1所述阳离子多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)阳离子多糖I的合成：将干燥的凝胶多糖溶于有机溶剂中，在氮气保护下加入三苯基膦、四溴化碳、叠氮化钠，反应生成阳离子多糖I，即6
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脱氧
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叠氮化凝胶多糖，反应方程式为：n为80～120；(2)阳离子多糖II的合成：
将6
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脱氧
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叠氮化凝胶多糖溶解于有机溶剂中，加入还原剂，加热反应得到6
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脱氧
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氨基凝胶多糖；反应方程式为：其中n为80～120；(3)化合III的合成：将6
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脱氧
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叠氮化凝胶多糖溶解于缓冲液中，加入短链脂肪酸、缩合剂、碱性催化剂反应，加入有机溶剂沉淀后用乙醇洗涤，干燥后即得；反应方程式如下：其中n为80～120；x为80％，y为10％；(4)化合IV的合成：将阳离子多糖III溶解在中性缓冲液中，加入腺苷酸和缩合剂，搅拌反应后，将反应混合物装进透析袋，在纯水...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡日查，清明，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：