一种α-1,3-葡萄糖苷酶在黑曲霉低聚糖制备中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种α

【技术实现步骤摘要】
一种
α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶在黑曲霉低聚糖制备中的应用


[0001]本专利技术涉及一种α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶在黑曲霉低聚糖制备中的应用，属于基因工程和发酵工程


技术介绍

[0002]黑曲霉低聚糖(Nigerooligosaccharides，NOS)是一类含有α
‑
1,3键的α
‑
D
‑
葡萄糖寡聚物，由于这种糖最早在日本的发酵清酒中被发现有少量存在，又称Sakebiose，其成分主要包括黑曲霉二糖、黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖和黑曲霉糖基麦芽糖等。与其他低聚糖相比，黑曲霉低聚糖具有特殊醇香风味、低黏度、低甜度(约是蔗糖的45％)等特点，是清酒、豆酱等发酵型产品具有特殊的良好口感的主要原因。它可代替砂糖加入各种饮料中以增加厚味，降低高甜度甜味剂的异味、苦味，同时具有协调咸味和在低盐下保持与增强鲜味的效果，对以鲜味为主体的各种饮料食品有味质调节效果。此外，黑曲霉低聚糖还具备预防龋齿、促进双歧杆菌增殖调节肠道健康、改善脂质代谢等生理功效，以及使T淋巴球和B淋巴球等免疫细胞活性化的免疫激活作用。
[0003]黑曲霉低聚糖的生产方法主要有化学合成、多糖水解法和酶催化转糖苷法3种。α
‑
葡萄糖苷酶催化的葡萄糖基转移反应是食品工业生产低聚异麦芽糖和黑曲霉低聚糖的重要反应，GH31家族α
‑
葡萄糖苷酶是具有高转苷活性的一类α
‑r/>葡萄糖苷酶，但目前该家族α
‑
葡萄糖苷酶的应用研究主要集中于催化合成α
‑
1,6糖苷键制备低聚异麦芽糖方面，对α
‑
1,3糖苷键具有高度选择性的α
‑
葡萄糖苷酶报道较少。目前已报道的具有α
‑
1,3糖苷键合成能力的α
‑
葡萄糖苷酶主要来源于真菌，如Acremoniun sp.S4G13分泌转化酶以麦芽糖为底物催化制备黑曲霉低聚糖的转化率可达37％，但其糖浆产品整体浓度仅20g/L(NOS约7.4g/L)，生产效率较为低下，且合成产物主要为黑曲霉二糖和黑曲霉糖基麦芽糖，而黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖以及DP≥4的黑曲霉糖基麦芽低聚糖则含量较低。本专利技术的目的在于利用一种细菌来源的α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶提高黑曲霉低聚糖的产量及转化率，同时提升所制备黑曲霉低聚糖组分中黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖的含量比例。

技术实现思路

[0004]α
‑
葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)可催化麦芽低聚糖、异麦芽糖、α
‑
葡聚糖等底物的非还原末端释放α
‑
D
‑
葡萄糖，或通过转糖基作用将葡萄糖基从供体底物转移至糖基受体生成低聚糖或糖苷衍生物。
[0005]本专利技术提供了一种重组大肠杆菌，表达Thermoplasmaacidophilum来源的α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶，所述α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]在一种实施方式中，以pET24a为表达载体。
[0007]在一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
[0008]本专利技术提供了一种制备黑曲霉低聚糖的方法，所述方法是利用氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶，或所述重组大肠杆菌表达的α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶，以麦芽
糖、葡萄糖或麦芽糊精中的一种或几种为底物，合成黑曲霉低聚糖。
[0009]在一种实施方式中，以麦芽糖和葡萄糖的混合物为底物，麦芽糖的浓度为100
‑
200g/L，葡萄糖的浓度为100
‑
200g/L。
[0010]在一种实施方式中，麦芽糖和葡萄糖的浓度均为100g/L，或葡萄糖的浓度为100g/L、麦芽糖的浓度为200g/L。
[0011]在一种实施方式中，α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶的添加量为0.5
‑
2U/mL。
[0012]在一种实施方式中，α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶的添加量不低于1U/mL。
[0013]在一种实施方式中，在pH5
‑
7、70
‑
90℃下反应。
[0014]在一种实施方式中，反应时间为1
‑
6h。
[0015]在一种实施方式中，反应时间为3
‑
6h。
[0016]本专利技术提供了所述重组大肠杆菌在制备黑曲霉低聚糖中的应用。
[0017]在一种实施方式中，所述黑曲霉低聚糖包括黑曲霉二糖、黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖和黑曲霉糖基麦芽糖。
[0018]本专利技术的有益效果：本专利技术将来源于Thermoplasmaacidophilumα
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶异源表达到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到一种高产α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶基因工程菌。利用本专利技术的α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶TaAglA以10％葡萄糖和20％麦芽糖为底物，α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶加酶量为1U/mL，在pH 6、温度80℃下进行酶反应，反应3h，黑曲霉低聚糖产量最高能达到88.5g/L，转化率为29.5％。以10％麦芽糖和10％麦芽糊精为底物，α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶加酶量为1U/mL，在pH 6、温度80℃下进行酶反应，反应6h，黑曲霉低聚糖产量最高能达到47.4g/L，转化率为23.7％。本专利所获得的黑曲霉低聚糖(NOS)产量远高于目前已有报道的Acremoniun sp.S4G1 3α
‑
葡萄糖苷酶制备产量7.4g/L。同时，本专利提出以10％麦芽糖和10％麦芽糊精为底物，同样获得了较高的黑曲霉低聚糖(NOS)转化率和产量，有利于拓宽黑曲霉低聚糖的底物范围和降低生产成本。
附图说明
[0019]图1为α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶TaAglA重组基因工程菌发酵酶液SDS
‑
PAGE电泳图；
[0020]图2为反应时间对α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶TaAglA制备黑曲霉低聚糖转化率的影响图；
[0021]图3为加酶量对α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶TaAglA制备黑曲霉低聚糖转化率的影响图；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达Thermoplasmaacidophilum来源的α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶，所述α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET24a为表达载体。3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。4.一种制备黑曲霉低聚糖的方法，其特征在于，所述方法是利用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶，或权利要求1
‑
3任一项所述重组大肠杆菌表达的α
‑
1,3
‑
葡萄糖苷酶，以麦芽糖、葡萄糖或麦芽糊精中的一种或几种为底物，合成黑...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，夏伟，毕然，黄燕，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：