游离锌离子浓度的荧光检测方法、曲线建立方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种游离锌离子浓度的荧光检测方法、曲线建立方法及试剂盒，本发明专利技术的检测方法使用携带目标基因的腺病毒感染待测胰岛β细胞，所述目标基因是连接了NPY基因的编码金属锌传感器的核苷酸序列；然后用单通道荧光显微镜进行胰岛β细胞的活体成像，获得发射的红色mRuby2荧光强度；再根据游离锌离子浓度

【技术实现步骤摘要】
游离锌离子浓度的荧光检测方法、曲线建立方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及细胞生物学和医学领域，特别涉及一种胰岛β细胞囊泡中游离锌离子浓度的荧光检测方法、曲线建立方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)是指距离很近(一般在10nm范围以内)的两个荧光分子之间产生的能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，且两个分子距离足够近时，就会发生一种非放射性能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光猝灭(强度比它单独存在时低)，而受体发射的荧光大大增强。
[0003]2型糖尿病或者其他β细胞缺锌造成的疾病，其患者β细胞囊泡中的游离锌离子浓度显著低于正常的β细胞。现有技术只能通过荧光共振能量转移技术(FRET)对β细胞囊泡中游离的锌离子进行测量，对成像设备要求高，需要双通道的激光和复杂的计算过程。
[0004]在此前的研究中，报道了使用人源TRIM72(MG53)蛋白的环状基序(ring motif)得到的金属本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种游离锌离子浓度的荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离待测胰岛β细胞；(2)使用携带目标基因的腺病毒感染所述待测胰岛β细胞；所述目标基因是连接了NPY基因的编码金属锌传感器的核苷酸序列，所述金属锌传感器基于人源TRIM72蛋白的环状基序，所述环状基序的N端连接mNeonGreen荧光蛋白分子，所述环状基序的C端连接mRuby2荧光蛋白分子；(3)所述腺病毒感染待测胰岛β细胞后，清洗细胞，于细胞培养箱中培养后进行胰岛β细胞的活体荧光显微镜成像；荧光显微镜成像采用单通道：用521～601nm激光激发mRuby2，收集mRuby2发射的红色荧光；(4)利用检测步骤(3)中收集的mRuby2荧光强度，根据游离锌离子浓度
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mRuby2荧光强度工作曲线计算出待测胰岛β细胞囊泡中的平均游离锌离子浓度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述感染时间为7～9小时。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述感染时间为8小时。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述激光波长为561nm。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的所述游离锌离子浓度
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mRuby2荧光强度工作曲线的建立需要三通道成像，通过第一通道和第二通道采集到的荧光强度，由公式计算出游离锌离子浓度，作为横坐标；第三通道中的mRuby2荧光强度作为纵坐标；使用一元一次方程进行线性拟合，得到游离锌离子浓度
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mRuby2荧光强度工作曲线。6.一种游离锌离子浓度
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mRuby2荧光强度工作曲线的建立方法，包括如下步骤：(S1)分离胰岛β细胞；(S2)使用携带目标基因的腺病毒感染胰岛β细胞；所述目标基因是连接了NPY基因的编码金属锌传感器的核苷酸序列，所述金属锌传感器基于人源TRIM72蛋白的环状基序，所述环状基序的N端连接mNeonGreen荧光蛋白分子，所述环状基序的C端连接mRuby2荧光蛋白分子；(S3)所述腺病毒感染胰岛β细胞后，清洗细胞，于细胞培养箱中培养后进行胰岛β细胞的活体荧光显微镜成像；荧光显微镜成像分为三个独立的通道：第一通道采用448～528nm激光激发mNeonGreen，收集mNeonGreen发射的绿色荧光；第二通道采用448～528nm激光激发mNeonGreen，收集mRuby2发射的红色荧光；第三通道采用521～601nm激光激发mRuby2，收集mRuby2发射的红色荧光；(S4)根据所述第一通道和所述第三通道的荧光信号选择出第一通道和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王意，周梦璇，咸逸，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：