一种检测异源cfDNA的多重PCR引物设计、引物组及检测方法及其用途技术

本发明专利技术公开一种检测异源cfDNA的多重PCR引物设计、引物组及检测方法及其用途包括：基于筛选的SNP位点设计多重PCR引物：使用primer3 NGS

【技术实现步骤摘要】
一种检测异源cfDNA的多重PCR引物设计、引物组及检测方法及其用途


[0001]本专利技术涉及生物医药领域应用，尤其涉及一种检测异源cfDNA的多重PCR 引物设计、引物组及检测方法及其用途。

技术介绍

[0002]肾移植是临床治疗终末期肾病的优选手段，而影响肾移植术后患者生存率 的最重要原因为排斥反应的发生。移植排斥分为超急性、急性、边缘型急性、 亚临床急性或慢性,急性排斥反应(acute rejection,AR)是目前肾移植术后的主 要危险并发症，也是导致慢性排斥反应和移植肾失功的最重要的危险因素。早 期诊断及时治疗AR可以有效减少移植器官的病理损害程度，延长移植器官的存 活时间。
[0003]通常诊断发生急性排斥反应的指标有：患者临床表现、各项生化指标(丙氨 酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶和γ
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谷氨酰转移酶、肌酐或心肌酶谱) 和组织活检。前两项检测的灵敏度和特异性低，且检测结果依赖于临床医生的 临床经验易产生偏差。
[0004]穿刺活检一直是肾移植排异反应检测的金标准，但组织活检花费大，属创 伤性检查常伴随并发症，包括：疼痛、血尿、肾血肿、移植物血栓症、败血症、 休克和移植物衰竭等。近年来诊断肾移植急性排斥反应的发生，一直朝向寻找 非侵入性无创检测的方向努力。血清中肌酐水平的增高通常是诊断肾移植后排 斥反应的一个有效指标，但肌酐检测具有非特异性，除了肾排斥反应，肾移植 患者排异药物中毒引起的急性肾衰竭也会导致肌酐升高，因此，肌酐水平的监 测不宜单独作为判断肾移植排斥反应的依据。目前，肾移植患者面临的主要临 床问题之一就是缺少用于早期诊断和连续监控移植物排斥风险的高灵敏度、高 特异性且非侵入性的检测。
[0005]游离DNA(cell free DNA,cfDNA)，是指游离于细胞外的部分降解了的机 体内源DNA，主要来自于细胞的凋亡或坏死。异源或自体的体细胞突变DNA 都可以在本体的血液中检测到，例如孕妇、肿瘤患者和器官移植患者。由于 cfDNA的半衰期很短(16min)，cfDNA作为生物标志物的潜力巨大。Dennis Lo 最早在女性肝、肾移植患者的血浆中检测到来自男性供体组织的游离DNA，被 认为是供体器官在患者体内凋亡或坏死，细胞裂解释放出的cfDNA，游离DNA 可以作为器官移植排异的标志物(参见Presence of donor
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specific DNA in plasmaof kidney and liver
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transplant recipients.Lancet.1998 May 2；351(9112):1329
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30.)。 正常状态下受体血液中供体来源的cfDNA几乎没有或者含量是极低的，通过检 测器官移植受体中供体来源的cfDNA的比例，可用于判断器官移植后是否发生 排斥反应。
[0006]在中国专利文献CN106544407A中公开了一种确定受体cfDNA样本中供体来源 cfDNA的比例的方法，通过获取器官移植的受体样本的基因组DNA，对基因组 DNA目标区域捕获测序，用于基因分型；同时对移植后受体的血浆cfDNA样本 进行目标区域的捕获和测序，用以分析供体cfDNA占总cfDNA的比例。然而上 述文献中的技术方案在应用于检测肾移
植受体中的供体cfDNA比例时还存在如 下缺陷：一、文献中的SNP位点的选择仅以次等位基因频率(MAF)为筛选条 件，缺少对临床肾移植患者易突变基因，特别是相关药用基因组学检测，因此 缺少对肾移植排斥反应的针对性检测，无法为免疫排斥反应的个体提供临床个 体化用药依据；二、肾移植排斥反应的病人中，供体来源的cfDNA含量低于肺 移植和肝移植等器官移植排斥反应病人的外周血中cfDNA,使得将异源cfDNA 信号从测序错误和PCR扩增错误信号中区分出来的难度加大，文献中提供的 cfDNA建库方法无法实现对cfDNA的单分子特异性标记，在对测序数据分析时 会引入偏差和错误。我司已授权的专利ZL201710334862.1中公开了一种确定受 体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法与CN106544407A相比增加了 单分子特异性标记，克服了测序数据分析时会引入偏差和错误的问题，但以上 方法均是基于目标区域杂交捕获方法，存在耗时长，成本高的缺陷
技术实现思路

[0007]本专利技术主要解决的技术问题是提供一种检测异源cfDNA的多重PCR引物设 计、引物组及检测方法及其用途，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：一种检测SNP分子 标记的多重引物设计方法，其创新点在于：包括如下步骤：
[0009]S1：中国人群全基因组common SNP筛选
[0010]首先，选取dbSNP数据库中高频SNP位点，进行变异位点频率过滤，要求 VAF小于0.6且大于0.4；
[0011]进而选取二态SNP位点，过滤掉含有高频(VAF>0.1)(>＝3allele)SNP的位 点；
[0012]再过滤掉基因组比对非唯一Blacklist区：根据数据库提供的区域，删除处 于该区域的SNP位点；
[0013]选取GC分布均匀位点，通过统计SNP位点附件100bp的碱基序列GC含 量来判断附近位点GC分布情况；选取标准为0.4<GC％<0.6；
[0014]过滤已知致病位点：根据已知疾病数据库收录位点信息来过滤掉上述筛选 得到的SNP位点中已知致病位点；
[0015]S2：中国人群高频SNP位置筛选
[0016]将上一步过滤得到的SNP位点在中国人群数据库cmdb中注释，得到相应 变异频率信息；选取数据库中高频SNP位点，进行变异位点频率过滤，要求VAF 小于0.6且大于0.4；
[0017]进一步过滤GC分布不均一位点：以SNP附近60bp提取基因组序列得到的 一段DNA片段，对其分别截取前,中,后40bp分别统计各段GC含量，过滤掉任 意一段不符合0.4<GC％<0.6的SNP位点；
[0018]过滤附近的60bp范围内碱基唯一性较差的区域位点：以SNP附近60bp提 取基因组序列得到的一段DNA片段，对其分别截取30bp k
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mers分别统计k
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mers 出现频率，筛选掉含有非唯一k
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mers的片段对应SNP位点；并将DNA片段与 基因组序列比对，查找可能的除自身位置外比对位点，过滤掉出现的非唯一比 对位点；
[0019]过滤附近60bp(ACTG)n位点：以SNP附近60bp提取基因组序列得到的一 段DNA片段，对其分别统计每条序列所含AAAA,TTTT,CCCC,GGGG出现次 数，过滤掉含出现2次及以上次数的DNA片段对应SNP位点；
[0020]选取SNP在基因组上分布均匀位点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测SNP分子标记的多重引物设计方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：中国人群全基因组common SNP筛选首先，选取dbSNP数据库中高频SNP位点，进行变异位点频率过滤，要求VAF小于0.6且大于0.4；进而选取二态SNP位点，过滤掉含有高频(VAF>0.1)(>＝3allele)SNP的位点；再过滤掉基因组比对非唯一Blacklist区：根据数据库提供的区域，删除处于该区域的SNP位点；选取GC分布均匀位点，通过统计SNP位点附件100bp的碱基序列GC含量来判断附近位点GC分布情况；选取标准为0.4<GC％<0.6；过滤已知致病位点：根据已知疾病数据库收录位点信息来过滤掉上述筛选得到的SNP位点中已知致病位点；S2：中国人群高频SNP位置筛选将上一步过滤得到的SNP位点在中国人群数据库cmdb中注释，得到相应变异频率信息；选取数据库中高频SNP位点，进行变异位点频率过滤，要求VAF小于0.6且大于0.4；进一步过滤GC分布不均一位点：以SNP附近60bp提取基因组序列得到的一段DNA片段，对其分别截取前,中,后40bp分别统计各段GC含量，过滤掉任意一段不符合0.4<GC％<0.6的SNP位点；过滤附近的60bp范围内碱基唯一性较差的区域位点：以SNP附近60bp提取基因组序列得到的一段DNA片段，对其分别截取30bp k
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mers分别统计k
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mers出现频率，筛选掉含有非唯一k
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mers的片段对应SNP位点；并将DNA片段与基因组序列比对，查找可能的除自身位置外比对位点，过滤掉出现的非唯一比对位点；过滤附近60bp(ACTG)n位点：以SNP附近60bp提取基因组序列得到的一段DNA片段，对其分别统计每条序列所含AAAA,TTTT,CCCC,GGGG出现次数，过滤掉含出现2次及以上次数的DNA片段对应SNP位点；选取SNP在基因组上分布均匀位点:对SNP在基因组上分布的相对距过滤，选取位点间距离不小于5kb的SNPs用做下面引物设计；S3：Multiplex PCR引物筛选主要包括以下主要步骤：首先运用Primer 3 Based Software
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NGS
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PrimerPlex软件对选取的每100个SNP位点设计多重引物，设计参数为：【
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regions${regionsBED}
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ref${hg38}
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th${THREADS}
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run${running_name}
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minampllen80
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maxampllen120
‑
optampllen100
‑
minprimerlen17
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maxprimerlen25
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optprimerlen22
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minprimermelt60
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maxprimermelt68
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optprimermelt64
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minprimergc40
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maxprimergc60
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optprimergc50
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minprimerendgc0
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maxprimerendgc5
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optprimerendgc2
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maxprimerpolyn8
‑
maxprimercomplendth25
‑
maxprimercomplanyth35
‑
maxprimerhairpinth40
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maxprimernonspec10000
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maxoverlap50
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primernum150
‑
tries10000
‑
returnvariantsnum10
‑
minprimershift5
‑
optextampllen150
‑
maxextampllen150
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subst2
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maxnonspeclen200
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freq0.05
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nucs6
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minmultdimerdg1
‑6‑
minmultdimerdg2
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10
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【专利技术属性】
技术研发人员：蒋廷亚，刘海涛，刘枫，束礼平，梁经天，
申请(专利权)人：苏州奥根诊断科技有限公司，
类型：发明
国别省市：