核酸抗体联合检测致病菌的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了核酸抗体联合检测致病菌的试剂盒。本发明专利技术筛选获得特异性识别幽门螺旋杆菌单克隆抗体，将所述单克隆抗体标记量子点和其他抗体标记的硝酸纤维素膜制备获得抗体荧光量子点快速检测试纸，同时针对幽门螺旋杆菌DNA序列进行分析，选取保守区设计RPA引物和探针，并制备成为相应的检测试纸条；将两个检测方法进行组合使用，能够进一步提高检测的准确性，从而及早诊断，利于患者尽快治疗，适于大规模推广使用。模推广使用。

【技术实现步骤摘要】
核酸抗体联合检测致病菌的试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测领域,并且更具体地涉及核酸抗体联合检测致病菌的试剂盒。

技术介绍

[0002]幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）于1983年由澳大利亚学者Warren 和Marshall从慢性胃炎患者胃粘膜中成功分离出。H. pylori是一种革兰氏阴性螺旋状杆菌，在胃上皮细胞定居繁殖。大量研究证实，H. pylori是慢性胃炎、消化性溃疡及胃肠道淋巴瘤的主要致病因素，并与胃癌发生密切相关。1994年国际癌症研究中心（IARC）将H.pylori列为I 类致癌因子。目前，H. pylori的感染率在发达国达到30%～50%，在发展中国家则高达80%，而我国20岁以上的成年人感染率也达到32%～75%。
[0003]幽门螺旋杆菌的诊断方法可划分为侵入性方法和非侵入性方法，其中侵入性方法包括细菌培养、快速脲酶试验和组织学检测等；这些方法具有足够的敏感性和特异性，但成本高，需要专业人员操作，还可能引起患者不适，不利于临床应用，更不适用于大批量检测。非侵入方法包括呼吸实验（UBT）、粪便抗原检测和血清学试验等；非侵入性方法不需借助胃镜检查、患者依从性较好，因而具有临床实际意义，但易受感染，出现假阳性。此外，基因检测技术即不受临床治疗用药的干扰，又可检测有无H. pylori的感染，同时也能检测细菌的基因型；基因诊断技术同样可以直接用于胃液、唾液、粪便等标本的检测，具有较高的可信度，在疾病诊断方面得到了广泛应用。但幽门螺旋杆菌的DNA突变性非常高，存在大量的变异，具有高度不一致性，很容易造成假阴性的结果。因此，现有方法的临床敏感性不是十分理想。

技术实现思路

[0004]为了更好规避以上缺陷 ,为患者提供尽早、准确的诊断结果，提供了一种制备简单、成本低廉、使用方便、不需要高精尖仪器、更为准确、高效的检测试剂盒。所述试剂盒通过核酸
‑
抗体双重检测方法对幽门螺旋杆菌进行检测，能更有效检测幽门螺旋杆菌, 从而及早诊断，利于患者尽快治疗。
[0005]本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种特异性结合幽门螺旋杆菌的单克隆抗体3F8，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示；该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示。
[0006]另一方面，本专利技术提供一种特异性结合幽门螺旋杆菌的单克隆抗体3F8，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO :7，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO :8。
[0007]在一些实施方案中，本专利技术所述的抗幽门螺旋杆菌抗体包含两条重链和两条轻
链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本专利技术的抗体可以是全长抗体，所述全长抗体包含恒定区，所述全长抗体轻链恒定区进一步包含鼠源κ、λ链序列。所述全长抗体重链恒定区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或IgM序列。
[0008]在一些实施方式中，本专利技术的抗幽门螺旋杆菌抗体是由上述的抗幽门螺旋杆菌抗体或抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。
[0009]本专利技术另外提供一种幽门螺旋杆菌荧光量子点快速检测试纸，其中将3F8单克隆抗体标记量子点配制备而成。
[0010]本专利技术提供另外一种用于快速检测幽门螺旋杆菌的试纸条RPA(LFD RPA)检测试剂盒，含有侧流层析试纸条，以及有一对引物和一条探针，其中所述上游引物序列如SEQ ID NO :9所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO :10所示，所述探针的序列如SEQ ID NO :11所示。
[0011]具体的，上游引物(SEQ ID NO :9)：CGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGC下游引物(SEQ ID NO :10)：Biotin
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CGGATTTTACCCCTACACCAAGAATTCCACCTAC探针序列(SEQ ID NO :11)：FAM
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CGTAAAGAGCGCGTAGGCGGGATAGTCAGTCAGGTGTGAAATCCTATG,在一些实施例中，本专利技术的探针在中间距5
’
端36bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5
’
端35bp和37bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3
’
末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。
[0012]在一些实施例中，如上所述的核酸探针，所述荧光基团可替换为TAMARA，所述淬灭基团可替换为BHQ2；所述的脱碱基位点可替换为四氢呋喃；所述探针3
’
端的C3Spacer修饰可替换为磷酸化设计或连接biotin
‑
TEG。
[0013]所述试纸条带有检测线，检测线上固定有分子A；序列如SEQ ID NO.10所述的引物，其末端带有特异性结合前述分子A的分子B。所述分子A是生物素配体，分子B是生物素。
[0014]在本专利技术所述的试纸条RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
[0015]本专利技术提供的试纸条法，RPA探针中间位置的两个胸腺嘧啶核苷酸上分别标记一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，两个基团之间设计一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被具有3'
‑
5'外切酶活性的核酸外切酶III识别、切割，游离荧光基团，从而发出荧光信号随后被荧光检测的仪器；同时留下可延伸3
’‑
OH，DNA聚合酶以探针为“正向引物”继续延伸合成DNA，与反向引物(带亲和标记，例如生物素)一起扩增出一种带有双重标记(荧光基团标记、亲和标记)的扩增产物；该产物在侧向流检测试纸中层析，遇到可识别亲和标记的试纸区域(通常为一条线，即“检测线”，带有链霉亲和素)时，则被富集，表现出线形荧光信号。试纸条法由于不依赖荧光定量PCR仪，成本和适用范围更广。
[0016]本专利技术进一步的，提供一种幽门螺旋杆菌的检测方法，它是使用前述引物和探针对样品进行扩增，再用核酸检测试纸条检测扩增产物即可。结果检测：结合试纸条进行显色，上述扩增产物吸取5μL
‑
25μL，用缓冲液1
×
PBST稀释10倍
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50倍，用相应标记的试纸条进行检测。结果判读：同时出现T线和C线为阳性(+)，仅出现C线为阴性(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合幽门螺旋杆菌的抗体，其特征在于: 所述抗体包括重链可变区，其包含SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3,以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。2.一种特异性结合幽门螺旋杆菌的抗体，其特征在于: 所述抗体重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示,轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。3.一种检测幽门螺旋杆菌的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有由权利要求1或2所述的抗体标记量子点制备而成的荧光量子点快速检测试纸条。4.一种核酸
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抗体双重检测幽门螺旋杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求3所述的试剂盒和试纸条RPA检测试剂盒，所述试纸条RPA检测试剂盒包括一对引物和一条探针，所述的一对引物的序列如SEQ ID NO:9和1...

【专利技术属性】
技术研发人员：马红妙，张玲，
申请(专利权)人：北京保图生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：