一种携带修饰的小RNA的建库方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种携带修饰的小RNA的建库方法，至少包括如下步骤：1）利用氨基酸去除试剂去除携带修饰的小RNA末端的氨基酸残基；2）利用第一转化剂使携带修饰的小RNA的5

【技术实现步骤摘要】
一种携带修饰的小RNA的建库方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因测序领域，特别是涉及一种携带修饰的小RNA的建库方法及其应用。

技术介绍

[0002]非编码RNA中包含多种小RNA如siRNA、miRNA、piRNA等，它们组成了细胞中高度复杂的小RNA调控网络，在调节个体发育、细胞增殖分化、肿瘤的发生发展及抗病毒等整个细胞水平几乎所有事件中起着重要的调控作用。
[0003]近年来随着高通量RNA测序(RNA
‑
seq)技术的发展，我们认识了细胞中丰富的RNA世界。同时大量的新类型的小RNA在不同的物种中被发现和报道，其中有tsRNA(tRNA来源的小RNA)，rsRNA(rRNA来源的小RNA)，rasiRNA(重复相关的siRNA)，hcRNA(异染色质RNA)和PASR/TASR(启动子终止子相关的小RNA)等。传统的RNA
‑
seq是在RNA的末端加上接头，再利用与3
’
端接头互补的引物进行逆转录。这种方法适用于结构特征为5
’‑
磷酸基团，3
’‑
羟基基团的转录本，绝大多数miRNA符合此类结构，故针对miRNA的测序技术相对成熟。然而，对于末端或内部携带修饰的小RNA，由于其会干扰末端接头的连接或阻碍反转录进程，从而使得大量带修饰的小RNA不能被成功建库，进而被当做垃圾片段而忽略。2015年《Nature Methods》上的两篇文章通过在文库制备前用酶处理去除tRNA的修饰，解决了tRNA测序的技术难题。同时，该方法发掘了大量携带甲基化修饰核苷的tRNA
‑
fragment。很多研究表明tRNA也能被切割成更小的RNA，其丰度甚至比microRNA更丰富。tRNA
‑
fragment的相关研究表明其参与了细胞增殖，肿瘤形成，干细胞发育，跨代遗传等过程。这些研究成果都说明，生命体中存在着丰富的携带修饰的小RNA，它们蕴藏大量的生物学信息与机体发育，肿瘤形成等多种生理病理的发生发展密切相关，亟待进一步被发掘研究。
[0004]建立能够捕获末端及内部携带修饰的小RNA建库方法是发掘和完善小RNA及深入研究其潜在功能的首要待攻克技术壁垒。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种携带修饰的小RNA的建库方法及其应用。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种携带修饰的小RNA的建库方法，至少包括如下步骤：
[0007]1)利用氨基酸去除试剂去除携带修饰的小RNA末端的氨基酸残基；
[0008]2)利用第一转化剂使携带修饰的小RNA的5
’
端的5
‑
cap转化为5
’
P；
[0009]3)利用第二转化剂使携带修饰的小RNA的5
’
端的5
’‑
OH转化为5
’
P，3
’
P和2
’
，3
’‑
cP端转化为3
’‑
OH；
[0010]4)利用去甲基化试剂去除携带修饰的小RNA的甲基化修饰；
[0011]5)将携带修饰的小RNA连接测序接头；
[0012]6)利用包括逆转录酶在内的逆转录试剂将携带修饰的小RNA反转录成cDNA；
[0013]7)将cDNA纯化后进行PCR扩增，获得携带修饰的小RNA的测序文库。
[0014]本专利技术第二方面提供前述携带修饰的小RNA的建库方法在基因测序领域中的用途。
[0015]如上所述，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种新的小RNA建库方法，克服了末端修饰及甲基化在反转录过程中的阻碍；利于末端接头的有效连接；具有优越的持续性和保真度；降低了由于PCR扩增而导致的序列丰度的偏好性，数据分析真实可靠；为携带修饰的小RNA提供了一个强大的灵敏的分析工具进而为生命体内丰富复杂的携带修饰小RNA的功能及其在生理病理等过程中的角色扮演奠定坚实的研究基础。
附图说明
[0016]图1a：本专利技术CPA
‑
seq的原理及流程简略图。
[0017]图1b：HEK293T细胞中不同建库方法对应的小RNA种类注释图。
[0018]图1c:NEBNext、QIAseq和TruSeq和CPA
‑
seq四种小RNA建库方法对HEK293T细胞的小RNA进行建库测序分析。
[0019]图1d:四种小RNA建库方法能检测到的不同类型小RNA数量的Venn图。
[0020]图2a：T4 PNK激酶响应的小RNA，对T4 PNK激酶响应的小RNA的分布和种类。
[0021]图2b.T4 PNK激酶响应的小RNA，对T4 PNK激酶响应的来源于核糖体RNA的小RNA在5s核糖体RNA、18s核糖体RNA和28s核糖体RNA的分布。
[0022]图2c.T4 PNK激酶响应的小RNA，表达量最高的T4 PNK激酶响应的tsRNA(左)，tsRNA(GluCTC)的测序长度分布图和Northern blot结果(右)。
[0023]图3a：对Cap
‑
Clip响应的小RNA的分布。
[0024]图3b：对Cap
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Clip响应的snRNA衍生的小RNA的分布。
[0025]图3c：CPA
‑
seq可检测到snRNA来源的5'端具有帽子结构的小RNA；用与RNU1 5'互补的序列作为探针对不同酶处理的小RNA进行Northern杂交，可观察到Cap
‑
Clip处理成功将RNU1的5'端帽子去除从而使得其可以被核酸外切酶XRN1所切割。
具体实施方式
[0026]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。
[0027]在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0028]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、
quantitative high
‑
throughput tRNAsequenci本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种携带修饰的小RNA的建库方法，至少包括如下步骤：1)利用氨基酸去除试剂去除携带修饰的小RNA末端的氨基酸残基；2)利用第一转化剂使携带修饰的小RNA的5
’
端的5
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cap转化为5
’
P；3)利用第二转化剂使携带修饰的小RNA的5
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端的5
’‑
OH转化为5
’
P，3
’
P和2
’
，3
’‑
cP端转化为3
’‑
OH；4)利用去甲基化试剂去除携带修饰的小RNA的甲基化修饰；5)将携带修饰的小RNA连接测序接头；6)利用包括逆转录酶在内的逆转录试剂将携带修饰的小RNA反转录成cDNA；7)将cDNA纯化后进行PCR扩增，获得携带修饰的小RNA的测序文库。2.如权利要求1所述的携带修饰的小RNA的建库方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：a.所述携带修饰的小RNA为末端及内部携带修饰的小RNA；b.所述携带修饰的小RNA的核苷酸长度为15
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40nt；c.步骤1)中，所述氨基酸去除试剂选自Tris
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HCl缓冲液；d.步骤2)中，所述第一转化剂选自RNA5
’
酸性焦磷酸水解酶。3.如权利要求1所述的携带修饰的小RNA的建库方法，其特征在于，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹏羽，王鹤鸣，黄荣，李玲，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：