狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立技术方案

本发明专利技术公开了狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立。本发明专利技术中的一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆，是通过反向遗传操作获得的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；所述感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的反向遗传操作系统，是由含有所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达HBF-1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒组成。通过本发明专利技术的反向遗传操作系统拯救获得的重组病毒rHBF-1与亲本病毒wtHBF-1相比具有相似的生长特性，且大小、形态与典型的犬瘟热病毒的一致。本发明专利技术的提出为狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的拯救以及深入探索犬瘟热病毒的致病致弱分子机制提供了基础和技术手段。技术手段。

【技术实现步骤摘要】
狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立


[0001]本专利技术涉及一种病毒的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立，特别涉及一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立。本专利技术属于生物


技术介绍

[0002]犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)的自然感染宿主不断增多，对世界范围内的多种陆生和水生食肉动物都存在生命威胁。CDV对不同易感宿主致病性不同，可引起不同程度的全身性疾病，致死率也有不同。其中，家猫发病死亡率为0％，家养犬为50％，雪貂达到100％。犬瘟热对毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成了巨大经济损失。目前，我国人均拥有的宠物犬猫数量逐年增多，犬瘟热对人类公共卫生的影响已不容忽视。而且，已经证实CDV融合蛋白和血凝素蛋白在Paget's疾病中促进破骨细胞的形成，人类可能成为CDV的新宿主。
[0003]CDV为副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)成员，是单股负链、不分节段RNA病毒。根据血凝素(H)基因的遗传多样性，CDV被划分为7个基因型，但只有1个血清型。CDV基因组从3
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端到5
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端依次为：3
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端非编码区(3
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UTR)、核基因(N)、磷基因(P)(内部含有两个非结构蛋白基因C和V)、基质基因(M)、融合基因(F)、血凝素基因(H)、大聚合酶基因(L)和5
’<br/>端非编码区(5
’
UTR)。CDV基因组RNA在核蛋白N的包裹下，聚合酶蛋白(L)及其辅助因子磷蛋白(P)共同作用，形成核衣壳(RNP)，这是CDV最小感染单位，遵循“6碱基原则”的顺序合成加帽和启动病毒转录与翻译，产生子代病毒。
[0004]由于RNA病毒的基因组难以在体外任意操作，反向遗传技术的专利技术，为体外改造病毒RNA基因组提供了强有力的工具。目前，国内外学者建立了多个CDV反向遗传系统，但主要针对CDV弱毒疫苗株。CDV弱毒疫苗株与CDV强毒株在核苷酸序列上存在较大差异，并且，弱毒疫苗株一般不引起动物发病和死亡，不适合用于阐述犬瘟热病毒的致病机理。此外，CDV强毒虽然能导致动物发病和死亡，但体外分离和培养较为困难。CDV强毒无法感染野生型Vero细胞，只能感染表达信号淋巴细胞活化分子(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)的稳定细胞系，从而实现体外大量增殖。随着CDV强毒对细胞的适应和传代次数增加，可能会导致CDV强毒毒力和致病性下降。CDV强毒的这些特性，极大地限制了其反向遗传系统的建立，及CDV强毒相关重组病毒的拯救和增殖。因此，本专利技术构建了狐源犬瘟热病毒强毒株HBF-1的反向遗传系统。犬瘟热病毒强毒株HBF-1为从北极狐病料样品中分离的一株强毒(犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育及致病性研究，高晗等，中国预防兽医学报，2012年12月，第32卷，第12期)。为了区别野生型CDV病毒wtHBF-1株，我们在pcDNA3.2-HBF-1中人为添加了遗传标记位点。比较了重组病毒rHBF-1与wtHBF-1的体外生长特性。数据结果显示：本研究利用构建的狐源CDV强毒HBF-1反向遗传系统，成功拯救获得重组病毒rHBF-1，rHBF-1具有与野生型wtHBF-1相似的生长特性。本专利技术的提出为未来深入研究CDV的致病机
理和发病机制、致病性和新型疫苗提供了强有力的平台和工具。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；
[0006]本专利技术的目的之二在于建立一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传系统；
[0007]本专利技术的目的之三在于提供所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及其反向遗传系统在狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株拯救以及反向遗传学研究中的应用。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0009]本专利技术以适应Vero-dSlam细胞的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株为模板，构建了狐源犬瘟热病毒感染性cDNA克隆。获得病毒的全基因组序列后，用RT-PCR方法，分4个长片段扩增犬瘟热病毒的全基因组，通过酶切连接和无缝克隆的有机结合，将4个长片段顺次拼接、插入到真核表达载体pcDNA3.2(由pcDNA3.1改造多克隆位点而获得)的多克隆酶切位点处。经过酶切鉴定，确定获得狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的全长cDNA重组质粒(pcDNA3.2-HBF-1)，同时构建表达犬瘟热病毒强毒HBF-1株N、P、L蛋白的三个辅助质粒(pcDNA3.1-HBF-N、pcDNA3.1-HBF-P和pcDNA3.1-HBF-L)。经酶切和序列测定鉴定，全长重组质粒pcDNA3.2-HBF-1序列与预期一致。将全长质粒pcDNA3.2-HBF-1 5μg和三个辅助质粒pcDNA3.1-N 1μg，pcDNA3.1-P 0.8μg和pcDNA3.1-L 0.5μg，转染试剂X-treme GENE HP DNA 22μL，共转染BSR细胞，3天后，将细胞悬液接种到Vero-dSlam细胞上，37℃5％CO2培养5-10天，观察到犬瘟热病毒引起的典型合胞体病变。经过RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)，电镜观察鉴定，证实拯救出重组病毒rHBF-1株。因此，本专利技术成功建立了狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传系统，为狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的拯救以及深入探索犬瘟热病毒的致病致弱分子机制提供了基础和技术手段。
[0010]因此，在上述研究的基础上，首先，本专利技术提出了一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆，所述的感染性cDNA克隆是通过反向遗传操作获得的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；所述感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]其次，本专利技术还提出了一种获得所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的方法，包括以下步骤：
[0012](1)提取HBF-1病毒悬液的总RNA；
[0013](2)对获得的RNA进行反转录，获得cDNA。
[0014](3)利用四对引物F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4，以HBF-1基因组RNA的反转录产物cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶将HBF-1分4段进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小正确后进行凝胶回收；
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[0016]R1 5
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GCGTACGTGAAAGCAGTTTTGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆，其特征在于，所述的感染性cDNA克隆是通过反向遗传操作获得的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；所述感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种获得权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取HBF-1病毒悬液的总RNA；(2)对获得的RNA进行反转录，获得cDNA。(3)利用四对引物F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4，以HBF-1基因组RNA的反转录产物cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶将HBF-1分4段进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小正确后进行凝胶回收；F1 5
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F2 5
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(4)真核表达载体pcDNA3.1的改造对真核表达载体pcDNA3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列连接到通过PmeⅠ酶切过后的pcDNA3.1载体上，将改造后的载体命名为pcDNA3.2；(5)将F1、F2、F3、F4片段分别连接至pEASY-Blunt，测序，将测序正确的各基因片段分别依次连接到改造后的载体pcDNA3.2的CMV启动子下游，获得含有权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的质粒。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)获得的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，步骤(4)中带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、Cp...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛向红，卜研，闫喜军，赵传芳，赵建军，陈杰，廉士珍，胡博，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：