用于治疗结晶样视网膜变性的核酸分子及其用途制造技术

本申请涉及一种靶向细胞色素P450家族4亚家族V多肽2(CYP4V2)的gRNA，本申请还涉及含有人CYP4V2核苷酸序列的供体核酸分子。本申请还涉及所述gRNA和所述供体核酸分子在治疗结晶样视网膜变性中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗结晶样视网膜变性的核酸分子及其用途
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种用于基因编辑治疗结晶样视网膜变性的gRNA和供体核酸分子。
技术介绍
结晶样视网膜变性((Bietticrystallinedystrophy,BCD)，又名为结晶样视网膜色素变性、结晶样角膜视网膜变性(BiettiCrystallineCorneoretinalDystrophy)、结晶样视网膜病变(BiettiCrystallineRetinopathy)、Bietti视网膜变性(Bietti'sRetinalDystrophy))是一种致盲性的常染色体隐性遗传性视网膜变性疾病。CYP4V2基因是目前发现的BCD致病基因之一(Li等，AmJHumGenet.74:817-826,200)。CYP4V2属于细胞色素P450超家族，是亚铁血红素—硫醇盐蛋白细胞色素P450亚家族4(CYP4)的成员。目前，有多种治疗该病的方法，例如基因替代治疗方案，即使用病毒转染系统或者其他转染系统(如AAV、慢病毒、逆转录病毒)，将CYP4V2野生型基因转染到基因突变的细胞中，使基因突变细胞可以表达野生型CYP4V2。这种做法仅可以部分恢复突变细胞功能，并且疗效有限。原因为突变型的基因产物仍然存在于细胞中，这些突变蛋白会与正常基因产物存在竞争性抑制作用。因此，更加安全有效的治疗方法亟待被发现。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本申请提供了特异性靶向细胞色素P450家族4亚家族V多肽2(CYP4V2)的gRNA，其特异性靶向c.802-8_810del17bpinsGC突变位点，所述gRNA对所述突变位点具有好的切割效果，使得原先突变的CYP4V2基因产物不存在于细胞中。本申请还提供了一种供体核酸分子，其包含了不含c.802-8_810del17bpinsGC突变位点的正确的CYP4V2的核苷酸序列，所述供体核酸分子可以在内源性CYP4V2被所述gRNA剪切后，在基因突变细胞中修复CYP4V2的突变位点，产生了具有正常功能的CYP4V2蛋白，具有很好修复效果。本申请提供了一种包含所述gRNA和/或所述供体核酸分子的载体，能够使CYP4V2突变的细胞表达正确的细胞色素P450家族4亚家族V多肽2，具有良好的基因编辑修复效率。一方面，本申请提供了一种特异性靶向细胞色素P450家族4亚家族V多肽2(CYP4V2)基因的gRNA，其特异性结合c.802-8_810del17bpinsGC突变位点上下200bp内的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述的gRNA包含SEQIDNO：74、78-80、82-84中任一项所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述的gRNA包含5’-(X)n-SEQIDNO：74、78-80、82-84-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。在某些实施方式中，所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码所述的特异性靶向CYP4V2基因的gRNA。另一方面，本申请提供了供体核酸分子，其包含CYP4V2基因c.802-8_810del17bpinsGC突变位点上下800bp内正常野生型的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述的核酸分子包含SEQIDNO:64-66中任一项所示的核苷酸序列。另一方面，本申请提供了一种载体，其包含所述的分离的核酸分子和/或所述的供体核酸分子。在某些实施方式中，所述分离的核酸分子和所述供体核酸分子位于同一载体中。在某些实施方式中，所述的载体为病毒载体。另一方面，本申请提供了细胞，其包含所述的分离的核酸分子、所述的供体核酸分子和/或所述的载体。在某些实施方式中，所述的细胞包括HEK293细胞、肾上皮细胞和/或诱导性多能干细胞。在某些实施方式中，所述的细胞经修饰后具备分化能力。在某些实施方式中，所述的细胞可分化为3D-视网膜类器官。另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述的gRNA，所述的一种或多种分离的核酸分子，所述的供体核酸分子，和/或所述的载体，以及药学上可接受的载剂。另一方面，本申请提供了所述的gRNA，所述的一种或多种分离的核酸分子，所述的供体核酸分子，和/或所述的载体在制备治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病包括CYP4V2基因中c.802-8_810del17bpinsGC突变所导致的疾病。在某些实施方式中，所述疾病包括结晶样视网膜变性。另一方面，本申请提供了一种治疗结晶样视网膜变性的方法，所述方法包括以下的步骤：向有需要的受试者导入所述gRNA，所述的一种或多种分离的核酸分子，所述的供体核酸分子，和/或所述的载体。在某些实施方式中，所述导入获得了正常功能的CYP4V2蛋白。在某些实施方式中，所述导入包括注射。在某些实施方式中，其中所述导入包括视网膜下腔注射。另一方面，本申请提供了一种调节细胞中CYP4V2基因表达的方法，其包括向细胞导入所述的gRNA，所述的一种或多种分离的核酸分子，和/或所述的载体。本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及专利技术的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。附图说明本申请所涉及的专利技术的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及专利技术的特点和优势。对附图简要说明如下：图1A显示的是本申请所述sgRNA1-2对所述突变基因的dsDNA剪切结果；图1B显示的是本申请所述sgRNA3-5对所述突变基因的dsDNA剪切结果；图1C显示的是本申请所述sgRNA6-8对所述的突变基因的dsDNA剪切结果；图1D显示的是本申请所述sgRNA9-11对所述的突变基因的dsDNA剪切结果；图1E显示的是本申请所述sgRNA12-14对所述的突变基因的dsDNA剪切结果；图1F显示的是本申请所述sgRNA15对所述的突变基因的dsDNA剪切结果；图1G显示的是本申请所述sgRNA16-19对所述的突变基因的dsDNA剪切结果；图1H显示的是本申请所述sgRNA20-22对所述的突变基因的dsDNA剪切结果；图1I显示的是本申请所述sgRNA23对所述的突变基因的dsDNA剪切结果。图2显示的是本申请所述AAV-saCas9-puro载体的质粒图谱。图3显示的是经sgRNA8、sgRNA12、sgRNA13、sgRNA14、sgRNA16、sgRNA17本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性靶向细胞色素P450家族4亚家族V多肽2(CYP4V2)基因的gRNA，其特异性结合c.802-8_810del17bpinsGC突变位点上下200bp内的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.特异性靶向细胞色素P450家族4亚家族V多肽2(CYP4V2)基因的gRNA，其特异性结合c.802-8_810del17bpinsGC突变位点上下200bp内的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的gRNA，其包含SEQIDNO：74、78-80、82-84中任一项所示的核苷酸序列。


3.根据权利要求1-2中任一项所述的gRNA，其包含5’-(X)n-SEQIDNO：74、78-80、82-84-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。


4.根据权利要求1-3中任一项所述gRNA，其中所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。


5.一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项所述的特异性靶向CYP4V2基因的gRNA。


6.供体核酸分子，其包含CYP4V2基因c.802-8_810del17bpinsGC突变位点上下800bp内正常野生型的核苷酸序列。


7.根据权利要求6所述的核酸分子，其包含SEQIDNO:64-66中任一项所示的核苷酸序列。


8.载体，其包含权利要求5所述的分离的核酸分子和/或权利要求6-7中任一项所述的供体核酸分子。


9.根据权利要求8所述的载体，所述分离的核酸分子和所述供体核酸分子位于同一载体中。


10.根据权利要求8-9中任一项所述的载体，其为病毒载体。


11.细胞，其包含权利要求5所述的分离的核酸分子、权利要求6-7中任一项所述的供体核酸分子和/或权利要求8-10中任一项所述的载体。


12.根据权利要求11所述的细胞，其包括HEK293细胞、肾上皮细胞和/或诱导性多能干细胞。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽萍，孟祥，陈邵宏，和赛超，张凡，史天永，曾露颖，卢化，
申请(专利权)人：北京中因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11