抗人PD-1抗体晶体及其使用方法技术

本发明专利技术提供了用于产生晶体抗PD‑1单克隆抗体(mAb)的方法，其中所述mAb为派姆单抗或派姆单抗变体，该方法包括(1)混合包含(a)mAb、(b)聚乙二醇(PEG)和(c)添加剂的溶液以形成结晶溶液，所述添加剂选自咖啡因、茶碱、2’‑脱氧鸟苷‑5’‑单磷酸、生物活性赤霉素和所述生物活性赤霉素的药学上可接受的盐；(2)将结晶溶液孵育足够用于晶体形成的时间；和(3)任选地从溶液收获晶体抗PD‑1mAb。在特定实施方案中，PEG为PEG 3350，且添加剂为咖啡因。本发明专利技术还涉及通过本文所述方法产生的新型抗人PD‑1mAb晶体。使用几种生化方法对再溶解的晶体悬浮液的表征表明，再溶解的mAb晶体的生物物理性质与完整的抗体起始样品一致。本发明专利技术的晶体和方法适用于多种药物应用，例如纯化、储存、制剂和药物递送。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗人PD-1抗体晶体及其使用方法
本专利技术涉及产生抗PD-1单克隆抗体的晶体悬浮液的方法。本专利技术进一步涉及通过本文的方法产生的抗体晶体、包含该晶体的药物组合物及其使用方法。相关申请的交叉引用本申请要求于2018年10月31日提交的U.S.S.N.62/753,615的权益，其通过引用整体并入本文中。电子提交的序列表的引用本申请的序列表通过EFS-Web作为ASCII格式的序列表电子提交，其文件名为“24638WOPCT-SEQLIST-17OCT2019.TXT”，创建日期为2019年10月9日，和大小为10Kb。通过EFS-Web提交的该序列表是本说明书的部分，并通过引用整体并入本文。
技术介绍
治疗性和诊断性抗体已成为生物制药行业增长最快的领域。抗体作为治疗剂取得成功的关键方面是开发改进的方法来表达、纯化和鉴定这些蛋白质。一般而言，抗体治疗剂较大(通常大于150kDa)且性质上是复杂的，因而必须以化学计量的量而非催化的量施用。因此，生产和纯化规模已达到先前认为不可能达到的生产水平。还需要为如此大量的复杂分子开发稳定的制剂和递送策略。开发包含高浓度活性剂(如抗体或抗原结合片段)的稳定制剂对于意图用于对患者进行皮下施用的生物学制剂尤其重要，因为递送给患者的溶液体积大大减小。皮下施用是许多抗体的优选施用方法，部分地是因为它可以实现自身施用或使医疗专业人员(例如药剂师、医生或护士)更容易施用。治疗性抗体传统上以冻干形式或在溶液中制备。冻干的形式可表现出增强的长期稳定性，但需要在使用前重构，使其不是非常适合于自身施用。另一方面，稳定的液体制剂的开发更具挑战性，并且在使用前通常需要冷藏。靶向程序性死亡受体-1(PD-1)轴的免疫检查点治疗已在多种人类癌症的临床反应方面取得突破性进展(Brahmeretal.,NEnglJMed2012,366:2455-65；Garonetal.NEnglJMed2015,372:2018-28；Hamidetal.,NEnglJMed2013,369:134-44；Robertetal.,Lancet2014,384:1109-17；Robertetal.,NEnglJMed2015,372:2521-32；Robertetal.,NEnglJMed2015,372:320-30；Topalianetal.,NEnglJMed2012,366:2443-54；Topalianetal.,JClinOncol2014,32:1020-30；Wolchoketal.,NEnglJMed2013,369:122-33)。T细胞上的PD-1受体与其在肿瘤和免疫浸润细胞上的配体PD-L1和PD-L2的相互作用调节T细胞介导的免疫反应，并可能在人类肿瘤的免疫逃避中发挥作用(PardollDM.NatRevCancer2012,12:252-64)。PD-1与其任一配体的结合导致向T细胞传递抑制性刺激。靶向PD-1轴的免疫治疗包括针对PD-1受体的单克隆抗体(KEYTRUDATM(派姆单抗(pembrolizumab)),MerckandCo.,Inc.,Kenilworth,NJ和OPDIVOTM(纳武单抗),Bristol-MyersSquibb,Princeton,NJ)以及结合PD-L1配体的那些单克隆抗体(MPDL3280A；TECENTRIQTM(阿特珠单抗),Genentech,SanFrancisco,CA)。两种治疗途径已在多种癌症类型中证明了抗肿瘤效果。存在着对于改进的抗PD-1抗体的稳定制剂的需要，其用于例如癌症患者的治疗。优选地，这些抗体制剂不需要在施用前进行重构。另外，这些制剂使得能够施用比使用典型的溶液制剂容易地达到的浓度更高的抗体浓度，并且优选以足以方便地皮下递送的低粘度支持高浓度。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术涉及一种产生晶体抗PD-1单克隆抗体(mAb)的方法，包括：(a)混合：(i)包含约5mg/mL至约80mg/mL的mAb的水性缓冲溶液，其中抗PD-1单克隆抗体为派姆单抗或派姆单抗变体，(ii)聚乙二醇(PEG)，和(iii)选自以下的添加剂：咖啡因、茶碱、2’-脱氧鸟苷-5’-单磷酸、生物活性赤霉素如赤霉素A3和赤霉素的药学上可接受的盐，以形成结晶溶液，其中该结晶溶液具有约6.0至约8.8的pH，并且包含约2％至约40％重量/体积(w/v)的PEG和约0.1％至约0.30％w/v的添加剂；(b)将结晶溶液孵育足以形成晶体的时间段；和(c)任选地从溶液收获晶体抗PD-1mAb。在一些实施方案中，mAb为派姆单抗。在进一步的实施方案中，mAb是派姆单抗变体，其保持与PD-1结合的能力和与添加剂结合的能力。在特定实施方案中，添加剂为咖啡因。在一些实施方案中，结晶溶液进一步包含约1％至约10％的葡聚糖硫酸钠。在一个方面，本专利技术涉及通过本专利技术的方法制备的分离的抗PD-1晶体。在另一方面，本专利技术涉及包含与咖啡因复合的派姆单抗的分离的晶体，其中该晶体特征在于空间群P2221α＝β＝γ＝90°。在另一方面，本专利技术涉及包含与咖啡因复合的派姆单抗的晶体派姆单抗，其特征在于显示约182.16、181.54、179.99、109.36、108.23、103.58、76.88和76.04ppm处的峰的固态NMR13C谱。在另一方面，本专利技术涉及包含与咖啡因复合的派姆单抗的晶体派姆单抗，其特征在于显示约183.07、182.16、181.54、180.55、179.99、110.70、110.15、109.36、108.23、103.58、101.49、99.75、98.56、76.88、76.04、74.97、74.41、73.52、72.69、13.85、13.27、12.26和11.13ppm处的峰的固态NMR13C谱。本文还提供了包含本专利技术的抗PD-1mAb晶体和药学上可接受的载体的组合物。在一个方面，本专利技术提供了通过将本专利技术的晶体或组合物施用于有需要的患者来治疗癌症和/或传染病的方法。在特定实施方案中，组合物通过静脉内输注施用于患者。在替代实施方案中，晶体通过皮下注射施用于患者。附图说明该专利或申请文档包含至少一张以彩色绘制的图形。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的彩色副本在提出要求并支付必要费用后由专利局提供。图1A-1C显示了派姆单抗晶体悬液中的晶体的显微照片，其通过在30℃下使用SilverBulletBio结晶试剂A2的沉淀剂溶液和12.5％w/v的PEG3350，0.05MHEPES缓冲液，pH6.8进行蒸汽扩散获得。参见实施例1。200倍放大倍数的显微照片使用SONICCTM成像系统在30天后获取。图1A提供了以200倍放大倍数拍摄的晶体的可见光图像。图1B和1C分别提供了使用SONICCTM成像系统的UV-TPEF和SHG模式产生的图像。来自SHG和UV-TPEF的正像(positiveimage)指示了蛋白质晶体。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生晶体抗PD-1单克隆抗体(mAb)的方法，包括：/na)混合：/ni.包含约5mg/mL至约80mg/mL的所述mAb的水性缓冲溶液，其中所述抗PD-1mAb为派姆单抗或派姆单抗变体，/nii.聚乙二醇(PEG)，和/niii.选自以下的添加剂：咖啡因、茶碱、2’-脱氧鸟苷-5’-单磷酸、生物活性赤霉素和所述生物活性赤霉素的药学上可接受的盐；/n以形成结晶溶液，其中该结晶溶液具有约6.0至约8.8的pH，并且包含约2％至约40％重量/体积(w/v)的PEG和约0.1％至约0.30％w/v的添加剂；/nb)将所述结晶溶液孵育足以形成晶体的时间段；和/nc)任选地从所述溶液收获所述晶体抗PD-1mAb。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181031 US 62/753,6151.一种用于产生晶体抗PD-1单克隆抗体(mAb)的方法，包括：
a)混合：
i.包含约5mg/mL至约80mg/mL的所述mAb的水性缓冲溶液，其中所述抗PD-1mAb为派姆单抗或派姆单抗变体，
ii.聚乙二醇(PEG)，和
iii.选自以下的添加剂：咖啡因、茶碱、2’-脱氧鸟苷-5’-单磷酸、生物活性赤霉素和所述生物活性赤霉素的药学上可接受的盐；
以形成结晶溶液，其中该结晶溶液具有约6.0至约8.8的pH，并且包含约2％至约40％重量/体积(w/v)的PEG和约0.1％至约0.30％w/v的添加剂；
b)将所述结晶溶液孵育足以形成晶体的时间段；和
c)任选地从所述溶液收获所述晶体抗PD-1mAb。


2.根据权利要求1所述的方法，其中包含所述mAb的所述水性缓冲溶液进一步包含pH约5.0-约6.0的组氨酸缓冲液。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PEG和所述添加剂在与包含所述mAb的所述水性缓冲溶液混合之前混合在一起以形成沉淀剂溶液。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其中包含所述mAb的所述水性缓冲溶液在与所述添加剂混合前与PEG混合。


5.根据权利要求1或2所述的方法，其中包含所述mAb的所述水性缓冲溶液在与PEG混合前与所述添加剂混合。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述添加剂为赤霉素A3或其药学上可接受的盐。


7.根据权利要求1所述的方法，其中所述添加剂为约0.15％至约0.30％w/v的咖啡因或约0.25％至约0.30％w/v的茶碱。


8.根据权利要求1所述的方法，其中所述添加剂为咖啡因，并且所述结晶溶液进一步包含约1％至约10％w/v的葡聚糖硫酸钠。


9.根据权利要求8所述的方法，其中葡聚糖硫酸钠的量为约5％w/v。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述PEG以约5％至约15％w/v的量存在于所述结晶溶液中。


11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述PEG以约10％至约30％w/v的量存在于所述结晶溶液中。


12.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述PEG的分子量为约2500至约35000。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述PEG为PEG3350。


14.根据权利要求13所述的方法，其中所述结晶溶液的pH和所述结晶溶液中存在的PEG的量选自由以下各项组成的组：
a)所述结晶溶液的pH为约6.0，且PEG的量为2-4％w/v，
b)所述结晶溶液的pH为约6.4，且PEG的量为2-6％w/v，
c)所述结晶溶液的pH为约6.8-8.4，且PEG的量为6-12％w/v，和
d)所述结晶溶液的pH为约8.8，且PEG的量为10-12％w/v。


15.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述结晶溶液在约2℃至约37℃的孵育温度下孵育。


16.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述结晶溶液在约18℃至约25℃的孵育温度下孵育。


17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述结晶溶液加热至约50℃，然后冷却至约37℃或更低的温度。


18.根据权利要求17所述的方法，其中所述结晶溶液冷却至约18℃至约25℃的温度。


19.根据权利要求17所述的方法，其中所述结晶溶液冷却至约4℃的温度。


20.根据权利要求17所述的方法，其中所述孵育温度从约4℃升温至约10-40℃。


21.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述结晶溶液孵育约15分钟或更长时间。


22.根据权利要求21所述的方法，其中所述结晶溶液孵育约2小时或更长时间。


23.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述结晶溶液在孵育过程中旋转或搅拌。


24.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述结晶溶液中所述抗PD-1mAb的溶液浓度为约...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·雷彻特，W·W·普罗西瑟，杨孝育，C·斯特里克兰德，C·N·纳拉西曼，T·O·费舍曼，E·R·沃尔什，苏永超，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：美国;US