一种硅羟基磁珠及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种硅羟基磁珠的制备方法，包括步骤：微球制备‑表面改性处理‑聚合物Ⅰ/Fe

【技术实现步骤摘要】
一种硅羟基磁珠及其制备方法和应用
本专利技术涉及磁性材料
，更具体地说，它涉及一种硅羟基磁珠及其制备方法和应用。
技术介绍
DNA是基本的遗传物质，在蛋白质合成和一系列重大生命的生长和变异过程中起着决定性作用。以DNA为研究对象的生物技术，包括对DNA的提取、克隆、扩增、测序等一系列技术，近年得到飞速发展。甲基化游离DNA是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法应运而生。从基因组DNA片段中快速分离CpG甲基化DNA。富集的DNA可用于多种下游的应用，比如终点PCR(endpointPCR)或实时定量PCR(realtimePCR)分析正常或者疾病样本中特定位点的甲基化情况、重亚硫酸盐处理后的克隆和测序或扩增和标记后用于微阵列分析。因此甲基化过程中游离DNA的提取富集，尤其是微量DNA，对于甲基化DNA的研究工作具有重要的意义。游离DNA是存在于血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外DNA，主要来自于坏死或凋亡的肿瘤细胞，依据血浆中存在游离DNA的理论，采用磁珠作为固相吸附载体并使用特定设计的试剂体系及提取流程，建立一种简便、高效提取样本中甲基化游离DNA的方法，评价其作为用于样本的甲基化基因检测技术的可行性。游离DNA的提取目前用的比较多的是离心法和磁珠法。现有技术中，硅羟基磁珠可以从全血、组织、植物和微生物等样本中提取基因组DNA；每mg磁珠能从200μL全血中提取4-12μg基因组DNA。磁珠的制备的传统方法主要有Stober法(即溶胶-凝胶法)和微乳液法等。其中Stober法主要上硅前驱体在磁珠表面水解、聚合形成厚度均匀的硅氧网络结构层，该方法制备的磁珠因具有可调控反应时间、壳结构厚度均匀的特点而被广泛应用。但是该方法制备的磁珠，二氧化硅包覆氧化铁纳米颗粒的核壳结构不均匀，磁响应性能不佳，操作复杂。公布号为CN110304662A的中国专利技术专利，公开了一种硅羟基磁珠的制备方法，说明书[0012-0013]：将三氯化铁、柠檬酸三钠、醋酸钠以及多元醇混合均匀得到混合溶液，采用溶剂热法制备得到Fe3O4纳米粒子；采用原子层沉积法在上述Fe3O4纳米粒子的表面包覆SiO2膜，即得硅羟基磁珠。该法制备的硅羟基磁珠制备程序复杂，磁响应不灵敏，对游离的DNA浓度较低尤其是微量DNA的富集及样本检测误差较大，使用过程中会发生漏磁现象。公布号为CN112007605A的中国专利技术专利，公开了一种用于核酸提取的羟基纳米磁珠及其制备方法，该专利技术公开了一种用于核酸提取的羟基纳米磁珠，以超顺磁性氧化铁纳米磁珠为内核，二氧化硅为外壳得到羟基纳米磁珠核壳结构，结构简单磁响应快，但是该磁珠在使用过程中易漏磁。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供硅羟基磁珠的制备方法，该方法工艺流程简单，操作简便，原料成本低，适宜于工业化大批量生产；并提供一种硅羟基磁珠，具有磁响应均匀、灵敏，结构稳定、无漏磁，能够实现对甲基化过程的微量DNA进行纯手工或仪器自动化的高效富集，且避免在甲基化处理硫化纯化过程中的磁泄露。为实现上述目的，一方面，本专利技术提供了如下技术方案：一种硅羟基磁珠的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)微球制备：采用聚合物单体共聚法制备200nm～2μm大小均一的单分散聚合物Ⅰ微球；步骤(2)表面改性处理：对S1制备的微球进行表面改性处理；步骤(3)聚合物Ⅰ/Fe3O4壳磁体制备：以原位共沉淀的方法制备壳磁型聚合物Ⅰ/四氧化三铁磁性微球；步骤(4)聚合物保护层：在壳磁体上包覆一层聚合物Ⅱ；步骤(5)二氧化硅包覆：将步骤(4)制备的含保护层的磁性微球重新分散，再改性修饰，最后得到硅羟基磁珠。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(1)中所述聚合物单体为苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯酸、丙烯酸酯、马来酸酐等其中一种或两种；在本专利技术的一些实施方案中，步骤(4)中所述聚合物Ⅱ为有机玻璃、聚苯乙烯、聚甲基硅氧烷、聚酰胺、聚酰亚胺、丙烯酸树脂其中的一种。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(1)中所述共聚法为分散聚合、乳液聚合、悬浮聚合或溶胀聚合其中的一种。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(2)中所述表面改性处理为浓硫酸磺酸化、酯类或酸酐类水解其中的一种。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(3)中所述原位共沉淀的方法可以是氧化共沉淀方法，还可以是混合铁源共沉淀或还原共沉淀。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(4)中所述增加聚合物保护层的方法为单体聚合法或自组装封闭包覆法。在本专利技术的一些实施方案中，在步骤(5)碱性条件下添加硅烷偶联剂进行改性修饰。在本专利技术的一些实施方案中，在本专利技术的一些实施方案中，步骤(5)中将包含所述保护层的磁珠分散在纯化水和极性溶剂的混合液中，碱性条件下添加硅烷偶联剂进行改性修饰，通过控制硅烷偶联剂的添加量，将二氧化硅包覆层的厚度限制在1nm～1μm的范围，并通过调节反应速率，填补二氧化硅包覆层表面的空隙，使磁珠表面致密平整。在本专利技术的一些实施方案中，将包含所述保护层的磁珠分散在纯化水和极性溶剂的混合液中，添加氨水溶液调整pH值使反应环境为碱性，进行超声处理后，添加硅烷偶联剂进行改性修饰，30～80℃的温度下，机械搅拌2～8h，除去溶液，所得磁珠洗至中性，即得到硅羟基磁珠。在本专利技术的优选实施方式中，所述纯化水和极性溶剂的混合液为极性溶剂和纯化水的体积比＝(2～5)：1。在本专利技术的一些实施方案中，极性溶剂为乙醇，还可以为氨水溶液。在本专利技术的优选实施方式中，所述硅烷偶联剂可以是正硅酸乙酯，添加量为0.16～4.5mL。进一步地，所述硅烷偶联剂还可以是甲基三氧乙基硅烷、三甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷其中的一种。为实现本专利技术的另一个目的，基于以上技术方案制备得到能够应用于血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外游离DNA的提取和检测的硅羟基磁珠。在本专利技术的优选实施方式中，所述硅羟基磁珠为超顺磁珠，主要成分为四氧化三铁，二氧化硅的含量为0.05％～28％，表面富含硅羟基。在本专利技术的优选实施方式中，所述硅羟基磁珠为粒径大小为300-2000nm。最后，本专利技术还提供了一种利用所述硅羟基磁珠在富集甲基化游离DNA中的提取和检测方法。在本专利技术的优选实施方式中，所述硅羟基磁珠应用于包括血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外游离DNA的提取和检测。本专利技术方法中的生物样本来源没有特别的限制，可以是选自任何含有DNA的样品，包括但不限于血液或血浆、脑脊液等体液以及这些样品的处理品，任选地生物样本可以来自健康受试者或/和患者，例如肠癌CRC样本。在本专利技术的优选实施方式中，血浆或血清、脑脊液等体液中甲基化游离DNA的富集，并配合PCR试剂盒进行检测。本专利技术提供的PCR检测试剂盒，包括裂解液、转化试剂、结合液、清洗液和缓冲液等。...

【技术保护点】
1.一种硅羟基磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤(1)微球制备：采用聚合物单体共聚法制备聚合物Ⅰ微球；/n步骤(2)表面改性处理：对步骤(1)制备的微球进行表面改性处理；/n步骤(3)壳磁体制备：以原位共沉淀的方法制备壳磁型聚合物Ⅰ/四氧化三铁磁性微球；/n步骤(4)包覆聚合物保护层：在步骤(3)壳磁体上包覆一层聚合物Ⅱ作为保护层；/n步骤(5)包覆二氧化硅外壳：将步骤(4)制备的含聚合物Ⅱ保护层磁性微球改性修饰，得到硅羟基磁珠；/n其中，步骤(1)中所述聚合物单体为苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯酸、丙烯酸酯、马来酸酐等其中一种或两种；/n步骤(4)中所述聚合物Ⅱ为有机玻璃、聚苯乙烯、聚甲基硅氧烷、聚酰胺、聚酰亚胺、丙烯酸树脂其中的一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种硅羟基磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)微球制备：采用聚合物单体共聚法制备聚合物Ⅰ微球；
步骤(2)表面改性处理：对步骤(1)制备的微球进行表面改性处理；
步骤(3)壳磁体制备：以原位共沉淀的方法制备壳磁型聚合物Ⅰ/四氧化三铁磁性微球；
步骤(4)包覆聚合物保护层：在步骤(3)壳磁体上包覆一层聚合物Ⅱ作为保护层；
步骤(5)包覆二氧化硅外壳：将步骤(4)制备的含聚合物Ⅱ保护层磁性微球改性修饰，得到硅羟基磁珠；
其中，步骤(1)中所述聚合物单体为苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯酸、丙烯酸酯、马来酸酐等其中一种或两种；
步骤(4)中所述聚合物Ⅱ为有机玻璃、聚苯乙烯、聚甲基硅氧烷、聚酰胺、聚酰亚胺、丙烯酸树脂其中的一种。


2.根据权利要求1所述的硅羟基磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述共聚法为分散聚合、乳液聚合、悬浮聚合或溶胀聚合其中的一种。


3.根据权利要求1所述的硅羟基磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述聚合物Ⅰ微球为大小均一的单分散微球，粒径为200nm～2μm。


4.根据权利要求1所述的硅羟基磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述表面改性处理为浓硫酸磺酸化、酯类或酸酐类水解其中的一种。...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨承凤，鲍涛，刘成，周梦圆，王弢，
申请(专利权)人：安徽为臻生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34