一种改造谷氨酸棒杆菌启动子的重组菌株及其构建方法与产L-氨基酸的应用技术

本发明专利技术提供了一种对已知启动子进行饱和突变以筛选大量启动活性强度不同的启动子突变体，并对工业上产氨基酸的菌株中涉及氨基酸合成通路的基因前加入改造后的启动子，筛选出氨基酸产量进一步提高的菌株的方法，以及由此获得的突变启动子序列和获得重组菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种改造谷氨酸棒杆菌启动子的重组菌株及其构建方法与产L-氨基酸的应用
本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种产L-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
L-氨基酸的工业化生产方法中，发酵法是目前应用广泛的方式之一。对发酵法生产L-氨基酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。用于改善这些微生物的性能性质的方法包括诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-氨基酸等。以赖氨酸为例，赖氨酸作为食品以及饲料的添加剂，每年的产量大约在220万吨。目前工业上赖氨酸主要来源于谷氨酸棒状杆菌发酵生产，根据现有的文献报道赖氨酸在谷氨酸棒状杆菌中的产量约为220g/L，而该菌株的主要改造在于碳源摄取、ATP合成、NADPH合成等方面，却没有对赖氨酸代谢通路中的基因表达进行调控。德国ChristophWittmann教授在野生型谷氨酸棒状杆菌中，对赖氨酸代谢通路中的相关基因以及NADPH合成相关基因、三羧酸循环途径相关基因进行调控后将赖氨酸的产量提升到了120g/L，而对这些基因表达的调控全部采用了谷氨酸棒状杆菌中的强启动子Psod过表达这些基因。韩国CJ公司通过对ddh基因启动子区的特定位点进行突变，获得了活性更强的Pddh启动子，利用该启动子启动ddh基因的表达可明显提升谷氨酸棒状杆菌中二氨基庚二酸脱氢酶的活性，并提高赖氨酸的合成。韩国KAIST的KiJunJeong教授实验室利用GFP作为报告蛋白，随机合成70bp的启动子序列，通过FACS分选，筛选出了20条强度不同的启动子，并成功的利用其中的最强启动子PH36合成了746mg/L的木聚糖内切酶，然而该系列启动子为IPTG诱导型启动子。中国科学院天津工业生物技术研究所刘君教授通过固定的-10区(NNTANANT)和-35区(NNGNCN)随机构建了长度约为80bp的启动子突变库，通过高通量筛选出了一系列不同强度的启动子，应用这些启动子成功的将谷氨酸棒状杆菌中的苏氨酸产量提高到了12.8g/L，约为野生型菌株的6.1倍。现有的技术和方法都是过表达或者多拷贝谷氨酸棒杆菌中赖氨酸代谢通路中的关键酶基因，但实际上由于代谢通路调控的复杂性，通路中的产物和前体底物中存在相互协同或反馈抑制等作用，并非是用来过表达关键酶基因的启动子的强度越强，产物积累的越多。此外，目前一部分棒杆菌中的启动子没有具体运用到谷氨酸棒杆菌生产L-赖氨酸通路中，能够提高产物产量的强度适合的启动子需要进一步的验证。
技术实现思路
本专利技术通过对已知启动子进行饱和突变，筛选大量启动活性强度不同的启动子突变体，并对工业上高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌中赖氨酸合成通路的天冬氨酸激酶(lysC)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)和二氢甲基吡啶酸还原酶(dapB)等关键基因前加入改造后的启动子作为额外拷贝，筛选出赖氨酸产量进一步提高的菌株，从而达到进一步提高L-赖氨酸的合成的目的，并基于所述工作完成了本专利技术。本专利技术的方法和结果也同样可适用于对所有产氨基酸细菌进一步提高其产氨基酸能力的改造。本专利技术的第一个方面是提供一种筛选能提高L-氨基酸产量的启动子的方法。所述方法包括：(1)构建启动子-报告蛋白-载体的表达载体，所述启动子是已知启动子序列；(2)以步骤(1)中的表达载体为基础，对启动子序列进行饱和突变，构建所述启动子的饱和突变库；(3)根据报告蛋白的表达情况，筛选出启动子活性强度不等的启动子突变体；(4)将筛选出的不同启动子突变体，分别整合到产氨基酸的菌株的氨基酸代谢通路的不同基因中，获得具有启动子突变体的重组菌株，检测所述重组菌株的目标氨基酸产量，选择能够提高氨基酸产量的启动子突变体。根据本专利技术，所述报告蛋白可以是本领域已知或常规的报告蛋白，包括但不限于：mCherry、GFP、sfGFP、YFP、RFP等等。根据本专利技术，所述启动子可以是本领域已知或常规使用的各种启动子，例如：trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子、cj7启动子等，或者其他研究者已报道过的启动子，例如Promoterlibrary-basedmodulecombination(PLMC)technologyforoptimizationofthreoninebiosynthesisinCorynebacteriumglutamicum.AppliedMicrobiologyandBiotechnology.2018(102)4117-4130中报道的启动子。在本专利技术的一个实施方式中，所述启动子是H10，其序列如SEQIDNO:11所示。根据本专利技术，在步骤(1)之前可以任选包括选择用于步骤(1)的已知启动子序列的步骤，所述步骤包括构建已知启动子序列-报告蛋白-载体的表达载体，将其转化入产氨基酸的野生型菌株中，依据报告蛋白的表达情况，选择启动强度高的已知启动子序列，将其用于步骤(1)，并作为后续饱和突变基础的启动子序列。根据本专利技术，步骤(1)中所述载体可以是本领域已知或常规使用的表达载体，例如：pEC-XK99E等。根据本专利技术，步骤(2)中对启动子序列进行饱和突变，可以采用本领域已知的方式，例如通过合成带有饱和突变的引物，将所述突变引入启动子序列。在本专利技术的一个实施方式中，对启动子H10的RBS结合位点的非保守区域(NNAGGANNNNN)以及上游的5个碱基区域(NNNNN)进行饱和突变，构建其饱和突变库：GCTCNNNNNTTACCGGTCGGCTCTAAGCCGGCGGCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTATAGTCCGAGCACGGCGNNAGGANNNNN(SEQIDNO:10)。根据本专利技术，所述步骤(4)中，可以采用本领域已知的重组手段，将筛选出的启动子突变体整合到宿主菌株中，例如，同源重组。根据本专利技术，所述步骤(4)中，产氨基酸的菌株可以本领域已知的各种能够产氨基酸的菌株，包括各种野生菌株，或已被基因工程技术改造过的菌株。在本专利技术的一个实施方式中，所述产氨基酸的菌株是高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌YP97158，保藏编号：CGMCCNo.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355(记载于中国专利申请CN106367432A(申请日2016年9月1日，公开日2017年2月1日)中)。在本专利技术的一个实施方式中，将筛选出的启动子突变体整合到高产赖氨酸菌株YP97158的赖氨酸代谢通路基因中。根据本专利技术，所述步骤(4)中，将启动子突变体整合入菌株氨基酸代谢通路不同基因中，可以采本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选能提高L-氨基酸产量的启动子的方法，其特征在于，包括：/n(1)构建启动子-报告蛋白-载体的表达载体，所述启动子是已知启动子序列；/n(2)以步骤(1)中的表达载体为基础，对启动子序列进行饱和突变，构建所述启动子的饱和突变库；/n(3)根据报告蛋白的表达情况，筛选出启动子活性强度不等的启动子突变体；/n(4)将筛选出的不同启动子突变体，分别整合到产氨基酸的菌株的氨基酸代谢通路的不同基因中，获得具有启动子突变体的重组菌株，检测所述重组菌株的目标氨基酸产量，选择能够提高氨基酸产量的启动子突变体；/n在步骤(1)之前包括或不包括选择用于步骤(1)的所述已知启动子序列的步骤，所述步骤包括构建已知启动子序列-报告蛋白-载体的表达载体，将其转化入产氨基酸的野生型菌株中，依据报告蛋白的表达情况，选择启动强度高的已知启动子序列，将其用于步骤(1)。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选能提高L-氨基酸产量的启动子的方法，其特征在于，包括：
(1)构建启动子-报告蛋白-载体的表达载体，所述启动子是已知启动子序列；
(2)以步骤(1)中的表达载体为基础，对启动子序列进行饱和突变，构建所述启动子的饱和突变库；
(3)根据报告蛋白的表达情况，筛选出启动子活性强度不等的启动子突变体；
(4)将筛选出的不同启动子突变体，分别整合到产氨基酸的菌株的氨基酸代谢通路的不同基因中，获得具有启动子突变体的重组菌株，检测所述重组菌株的目标氨基酸产量，选择能够提高氨基酸产量的启动子突变体；
在步骤(1)之前包括或不包括选择用于步骤(1)的所述已知启动子序列的步骤，所述步骤包括构建已知启动子序列-报告蛋白-载体的表达载体，将其转化入产氨基酸的野生型菌株中，依据报告蛋白的表达情况，选择启动强度高的已知启动子序列，将其用于步骤(1)。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述启动子是H10，其序列如SEQIDNO:11所示。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中对启动子H10的RBS结合位点的非保守区域NNAGGANNNNN以及上游的5个碱基区域NNNNN进行饱和突变，构建其饱和突变库：GCTCNNNNNTTACCGGTCGGCTCTAAGCCGGCGGCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTATAGTCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗小舟，赵西西，冯庭叶，孟刚，魏爱英，赵春光，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44