一种解脲支原体感染的诊断标物及其对应的检测试剂盒的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种解脲支原体感染的诊断标物及其对应的检测试剂盒的制备方法与应用，诊断标物为含有UUR10_0579蛋白抗原决定簇位点的多肽，其氨基酸序列如序列1所示。发明专利技术通过定量ELISA检测病原体相关特异性抗体，具有快捷简便、高通量、结果重复性高的优点；其次UUR10_0579蛋白是解脲支原体早期感染的重要抗原，参与机体的免疫应答，因此可以将其作为解脲支原体感染的特异性诊断标志物。相比于目前临床上用于检测解脲支原体的方法，本发明专利技术提供的解脲支原体感染的检测方法具有早期、快速、敏感、特异、准确等优点，弥补了目前临床检测方法的缺陷。该检测方法的结果判定客观，操作简便，既适合大规模筛查试验，有能用于解脲支原体感染的最后的确诊诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种解脲支原体感染的诊断标物及其对应的检测试剂盒的制备方法与应用
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种解脲支原体感染的诊断标物及其对应的检测试剂盒的制备方法与应用。
技术介绍
解脲支原体(M.urealyticum，UU)亦称溶脲脲原体，是六种脲原体属中的一种，与人类泌尿生殖道感染有密切关系。菌体微小，仅为大肠杆菌的五分之一，是目前已知的最小、最简单的具有自我繁殖能力的原核生物。UU主要分布在人体的泌尿生殖道，是除沙眼衣原体外最常见的非淋性尿道炎的病原菌。其侵犯女性生殖道黏膜细胞引起阴道炎、宫颈炎，继续上行感染，吸附于输卵管黏膜，致使其纤毛脱落，上皮损害，可出现输卵管炎、子宫内膜炎等，还可通过母婴垂直传播引起宫内感染从而导致流产、死胎、早产、新生儿呼吸道感染等不良后果。男性感染后会引起前列腺炎、附睾炎、尿道炎症等。近年来，解脲支原体感染引起的非淋球菌性尿道炎已成为最常见的性传播疾病，且发病率呈上升趋势，因此，解脲支原体的检测在泌尿道系统疾病的诊断上具有重要意义。目前临床上用于检测解脲支原体的方法主要有：培养法、PCR法、免疫学方法等。培养法是传统的“金标准”方法，特异性高，但敏感性低、培养时间长、易污染等缺点因而限制了其在临床上的使用。PCR法具有敏感性、特异性高等特点，在临床诊断上具有优越性，但是需要特殊的仪器和专门的人员操作，在基层医院中难以推广。免疫学方法具有快速、简便和易于标准化等优势，在临床快速检测上具有很好的应用前景。但临床上用于检测解脲支原体的主要免疫学方法(金标法和荧光抗体法)具有一定的局限性。目前国内间接法检测支原体抗体应为定性试剂，但是由于支原体在人群中广泛存在，正常人也有低滴度抗体水平，因而不能仅依靠抗体定性检测来进行诊断；此外，单克隆抗体免疫荧光法检测解脲支原的影响因素较多，如涂片时没有取到细胞成分、固定时细胞成分丢失也可以造成假阴性结果。因而需要一种灵敏、快速、精确定量的检测方法。酶联免疫吸附实验(ELISA)为多种病原体，包括病毒、细菌、真菌和支原体等，最常用检测方法，具有操作简便、检测准确性高等特点，在临床和疾控中广泛应用。传统定性或者半定量ELISA价格便宜，为目前基层医院、疾控中心首选检测方法。随着临床检验技术的发展，定量ELISA具有更高准确性，更能反应患者机体免疫水平，在临床上逐步开展应用。UUR10_0579蛋白为一种新的糖基转移酶，分子量为37kDa,可催化合成糖脂，且是解脲支原体早期感染的重要抗原，参与机体的免疫应答。因而可以通过对UUR10_0579蛋白的特异性抗体进行定量检测来对解脲支原体感染进行早期诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种解脲支原体感染的诊断标物及其对应的检测试剂盒的制备方法与应用，建立一种新的解脲支原体检测技术，能够早期客观、灵敏和稳定地诊断解脲支原体感染。本专利技术这种解脲支原体感染的诊断标物为含有UUR10_0579蛋白抗原决定簇位点的多肽，其氨基酸序列如序列1所示。本专利技术这种解脲支原体感染的诊断标物制备检测试剂盒的方法，包括以下步骤：S1采用实验生物信息学软件分析UUR10_0579蛋白的氨基酸序列，预测并确定该UUR10_0579蛋白上的抗原决定簇位点，通过人工合包含该抗原决定簇位点的多肽，多肽的氨基酸序列如序列1所示；S2将步骤S1中人工合成出来的多肽作为抗原，用包被缓冲液进行稀释，得到稀释多肽液，以100μL/孔将稀释多肽液加入96孔酶标板中，4℃过夜洗板3次，然后向其中加入200μL含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1h后，洗板3次，凉干，用密封袋封装，得到预先包被UUR10_0579蛋白抗原的酶标板，保存备用；S3ELISA检测试剂盒的成分：⑴步骤S2中的预先包被UUR10_0579蛋白抗原的酶标板；⑵小牛血清3mLx1瓶；⑶酶标抗体3.2mLx1瓶；⑷阳性对照血清1mLx1瓶；⑸阴性对照血清1mLx1瓶；⑹浓缩洗涤液30mLx1瓶；⑺显色剂A4mLx1瓶；⑻显色剂B4mLx1瓶；⑼终止剂3.5mLx1瓶；⑽封板片3片；⑾血清标本稀释缓冲液1瓶。所述步骤S2中，包被缓冲液为0.05摩尔/升碳酸盐缓冲液，pH9.6，具体制备过程是将1.59克碳酸钠(NaCO3)和2.93克碳酸氢钠(NaHCO3)溶解于1000毫升蒸馏水中，溶解混匀；包被缓冲液将多肽稀释至10μg/mL。所述步骤S2中，磷酸盐缓冲液为0.01摩尔/升PBS，pH7.4，具体制备过程是将8.0克氯化钠(NaCl)，0.2克磷酸二氢钾(KH2PO4)，2.9克磷酸氢二钠(Na2HPO4`12H2O)和0.2克氯化钾(KCl)加入1000毫升蒸馏水，溶解混匀；封闭液：100毫升PBS中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。所述步骤S3中，酶标抗体为酶标二抗，优选为商品化的HRP(辣根过氧化物酶)标记的马抗鼠IgG；浓缩洗涤液为pH值＝7.4并且终浓度为0.1mol/L的PBS溶液中加入Tween-20，使得Tween-20的浓度为0.5％(v/v)，使用前用水稀释10倍；按30mL/瓶分装；显色剂A是将醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml，按4mL/瓶分装；显色剂B是将乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50ml,0.15gTMB蒸馏水加至500ml，按4mL/瓶分装；终止剂优选2mol/LH2SO4；血清标本稀释缓冲液优选pH7.2-7.5的磷酸缓冲液。所述的检测试剂盒检测UUR10_0579蛋白血清中特异性抗体的方法，包括以下步骤：(1)加样：取待检血清，加入血清标本稀释缓冲液进行稀释，混匀；(2)孵育：孔中加入小牛血清和步骤(1)中稀释待检血清标本各一滴，设阴/阳性对照各两孔，每孔加入阴性对照或阳性对照各两滴，在37℃下封板1h；(3)洗涤：微孔板甩去孔内液体，注入洗涤液，放置10s后，甩干，并重复4次；(4)加入酶标抗体：每孔加酶标记的抗体1滴，在37℃下封板1h；(5)洗板同前；(6)显色：加显色剂A与显色剂B各一滴，在37℃下静置20min；(7)终止反应：每孔加终止剂1滴；(9)观察记录结果：读取490nm处激发光时的OD光密度值，计算抗体含量。本专利技术的原理：本专利技术利用定量ELISA的原理提供一种可以定量检测患者血清中UUR10_0579蛋白的特异性抗体的定量ELISA抗体检测试剂盒。简而言之，酶联免疫吸附检测是一种基于免疫反应的检测方法，将抗体固化在载体上，加入抗原及催化酶标抗体进行免疫结合反应。当加入酶促底物后，底物被酶催化反应，形成显色产物。显色产物的浓度与待测物质的量直接或线性相关，因此可直接进行定量计算或定性分析。本专利技术利用解脲支原体的UUR10_0579蛋白作为抗原包被酶标板和阳性对照学血清制备抗原，制备定量ELISA抗体检测试剂盒，用于检测患者血清中UUR10_0579蛋白的特异性抗体并进行定量分析，由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种解脲支原体感染的诊断标物，其特征在于，所述的诊断标物为含有UUR10_0579蛋白抗原决定簇位点的多肽，其氨基酸序列如序列1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种解脲支原体感染的诊断标物，其特征在于，所述的诊断标物为含有UUR10_0579蛋白抗原决定簇位点的多肽，其氨基酸序列如序列1所示。


2.根据权利要求1所述的解脲支原体感染的诊断标物制备检测试剂盒的方法，包括以下步骤：
S1采用实验生物信息学软件分析UUR10_0579蛋白的氨基酸序列，预测并确定该UUR10_0579蛋白上的抗原决定簇位点，通过人工合包含该抗原决定簇位点的多肽，多肽的氨基酸序列如序列1所示；
S2将步骤S1中人工合成出来的多肽作为抗原，用包被缓冲液进行稀释，得到稀释多肽液，以100μL/孔将稀释多肽液加入96孔酶标板中，4℃过夜洗板3次，然后向其中加入200μL含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1h后，洗板3次，凉干，用密封袋封装，得到预先包被UUR10_0579蛋白抗原的酶标板，保存备用；
S3ELISA检测试剂盒的成分：⑴步骤S2中的预先包被UUR10_0579蛋白抗原的酶标板；⑵小牛血清3mLx1瓶；⑶酶标抗体3.2mLx1瓶；⑷阳性对照血清1mLx1瓶；⑸阴性对照血清1mLx1瓶；⑹浓缩洗涤液30mLx1瓶；⑺显色剂A4mLx1瓶；⑻显色剂B4mLx1瓶；⑼终止剂3.5mLx1瓶；⑽封板片3片；⑾血清标本稀释缓冲液1瓶。


3.根据权利要求2所述的解脲支原体感染的诊断标物制备检测试剂盒的方法.其特征在于，所述步骤S2中，包被缓冲液为0.05摩尔/升碳酸盐缓冲液，pH9.6，具体制备过程是将1.59克碳酸钠和2.93克碳酸氢钠溶解于1000毫升蒸馏水中，溶解混匀；包被缓冲液将多肽稀释至10μg/mL。


4.根据权利要求2所述的解脲支原体感染的诊断标物制备检测试剂盒的方法.其特征在于，所述步骤S2中，磷酸盐缓冲液为0.01摩尔/升PBS，pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军华，陈列松，陆路，黄蓉，张晶晶，
申请(专利权)人：中南大学湘雅三医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43