测定藻细胞中岩藻黄素含量的方法技术

本发明专利技术涉及理化检测领域，公开了一种藻细胞中岩藻黄素含量的分析方法，该方法包括两个途径，一个途径通过建立藻细胞样品提取液中通过化学法测得的含量与拉曼光谱测定的藻细胞提取液的特征峰的线性回归方程，一个途径通过建立通过化学法测得的单个藻细胞的岩藻黄素的含量与拉曼光谱测定的单个藻细胞的特征峰的线性回归方程；通过得到的线性回归方程检测单个藻细胞中岩藻黄素的含量。该方法能够快速无损的检测藻细胞中岩藻黄素的含量，不需要进行复杂的数据处理和分析，且灵敏度高、准确度高，可用于岩藻黄素藻种的筛选或藻细胞生理生化状态的分析。

【技术实现步骤摘要】
测定藻细胞中岩藻黄素含量的方法
本专利技术涉及岩藻黄素检测领域，具体地涉及一种测定藻细胞中岩藻黄素含量的方法。
技术介绍
岩藻黄素(Fucoxanthin)亦称岩藻黄质、褐藻黄素，为褐藻、硅藻、金藻和黄绿藻所含有的一种重要的类胡萝卜素，其中褐藻和硅藻类的含量更为丰富。岩藻黄素在藻细胞内以岩藻黄素-叶绿素a/c-蛋白质复合物(Fucoxanthin-chlorophyllproteincomplex，FCP复合体)的形式存在，扮演着光捕获色素的角色而参与光合作用。另外其分子结构比较特殊，除含有长链共轭双键结构外，还含有不常见的丙二烯键和5，6-单环氧结构。岩藻黄素独特的分子结构，赋予了其多种强大的生物学功能，例如：抗肥胖、抗氧、抗肿瘤、抗炎症、降血糖/血脂、保肝护肝等药理作用。因此成为研究的热点，并在医药、保健品及饲料添加剂等领域得到广泛应用，当前岩藻黄素的市场需求约为10吨/年。近年来，随着国民生活水平的大幅提高，涉及人类健康领域的消费需求日益增长，因此含有岩藻黄素的产品具有广阔的应用前景和巨大的市场需求。目前，岩藻黄素的生产原料主要来源于大型褐藻中，如海带、裙带菜等。但是海带中的岩藻黄素含量极低，多在0.01-0.05％，最高不过0.1％(占细胞干重)。由于海带中岩藻黄素的含量很低，导致2000公斤海带中仅能提取得到约1公斤的岩藻黄素(纯度为10％)。而且，从海带中提取岩藻黄素的成本高昂，导致市场上含量1％的岩藻黄素价格高达200美元/kg。从目前的技术来讲，利用大型褐藻生产岩藻黄素很难以实现工业化，在这样的情况下，开发新的岩藻黄素来源是实现岩藻黄素大规模生产的关键，如何筛选富含岩藻黄素的藻种就是一个必须要面临的问题。现有的对藻细胞内岩藻黄素含量的分析测定方法包括高效液相色谱法(HPLC)、紫外分光光度计法(UV)和荧光检测的方法。比如，在CN108279204A中公开了一种快速无损检测三角褐指藻胞内岩藻黄素的方法，具体的使用用流式细胞仪检测藻细胞在533nm或585nm发射波长下的平均荧光强度值，将三角褐指藻悬浮液样品的岩藻黄素含量的对数值和相应测得的平均荧光强度值的对数值作线性回归，得到了R2＝0.9267的线性回归方程，三角褐指藻胞内岩藻黄素含量的定量下限为3.24mg/g干藻粉。就HPLC检测方法而言，检测需对样品进行预处理，比如干燥和色素提取等步骤，分析流程时间较长，同时还需要消耗大量的有机试剂等，从而使得岩藻黄素的生产工艺和质量控制费时费力。对于UV法而言，通常岩藻黄素样品自身含有大量的其它色素，而UV法检测时也需要对样品进行预处理，将色素提取后进行UV检测，由于色素提取过程中无法提取纯度较高的岩藻黄素，也就无法排除其他色素和杂质可能带来的UV吸收，从而无法对岩藻黄素进行精确而准确的定量测定。对于荧光检测方法而言，由于岩藻黄素在藻细胞内是以岩藻黄素-叶绿素a/c-蛋白质复合物(Fucoxanthin-chlorophyllproteincomplex)的形式存在，故得到的岩藻黄素的荧光信号受叶绿素的影响较大，在藻细胞的不同的生理阶段时，叶绿素的含量会随之变化，因此岩藻黄素的荧光信号也会随之受到影响，从而对测试结果的准确度有一定的影响。除此之外，上述方法还需要较大量的藻细胞。因此开发一种可提高检测效率、简化检测工序、杂色素干扰少、可信度高的岩藻黄素检测方法非常有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中存在的检测效率低、检测工序和数据处理复杂、杂色素干扰较多、可信度较低等问题，提供了一种测定藻细胞中岩藻黄素含量的方法，该方法能够快速检测藻细胞内的岩藻黄素含量，不需要进行复杂的数据处理和分析，基本不受细胞内其他物质的影响，而且灵敏度和准确度高，可用于岩藻黄素藻种的筛选、藻细胞岩藻黄素含量的测定或藻细胞生理生化状态的分析。为了实现上述目的，本专利技术提供一种藻细胞中岩藻黄素含量的分析方法，该方法包括以下步骤：S1、取若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品；S2、通过化学法分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品的提取液中岩藻黄素的含量；S3-1、拉曼光谱分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品的提取液中岩藻黄素的特征峰总面积；S4-1、建立所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品的提取液中岩藻黄素的特征峰总面积和岩藻黄素的含量的线性回归方程；或者S3-2、拉曼光谱分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积；S4-2、分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中藻细胞的密度，根据步骤S2得到的岩藻黄素的含量分别计算单个藻细胞中岩藻黄素的含量，并建立所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积和单个藻细胞中岩藻黄素的含量的线性回归方程；S5、拉曼光谱测定待测藻细胞样品的提取液或者单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积，根据S4-1或S4-2中得到的所述线性回归方程，计算所述待测藻细胞样品提取液或者单个藻细胞中岩藻黄素的含量，作为所述待测藻细胞中岩藻黄素的含量。优选地，所述拉曼光谱的测定条件包括：到达样品上的激光功率为0.01-100mW，单次采集的积分时间为0.01-100s，物镜为10-100倍。优选地，步骤S3-2中，所述拉曼光谱的方法包括采用中心点扫描模式或全细胞扫描模式采集所述藻细胞样品中1-100个藻细胞的拉曼光谱图，以其平均的特征峰峰面积作为若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积。应当理解的是，每个细胞样品可以得到一个拉曼光谱图，将多个藻细胞的拉曼光谱图叠加并平均后能够得到一个平均的拉曼光谱图，从平均的拉曼光谱图中能够得到平均的特征峰总面积，将其作为若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积。其中，所述藻细胞的数量可以为1个、2个、5个、10个、20个、40个、60个、80个、100个以及任意两个值之间组成的任意范围。更优选地，采用全细胞扫描模式采集所述藻细胞样品的拉曼光谱图。本专利技术利用拉曼光谱技术对藻细胞的岩藻黄素含量进行检测，建立了藻细胞岩藻黄素含量与岩藻黄素拉曼光谱特征峰的线性回归关系，使得快速无损的定量检出藻细胞内岩藻黄素的含量成为可能。采用本专利技术的一种方法进行样品检测时，不需要破坏细胞结构，无需有机溶剂提取，通过非常短时间的扫描和非常简单的数据分析，便可以快速对藻细胞内的岩藻黄素含量进行定量分析，便于筛选高岩藻黄素含量的藻种。而且本专利技术所述的技术方案测定的结果与传统方法相比，可检测单个藻细胞内的岩藻黄素的拉曼光谱信号强度，且与HPLC法测定的岩藻黄素的含量之间的相关性R2可达0.98，能够用于单个藻细胞中岩藻黄素的定量分析，且结果可信度高。与其他检测方法(比如荧光检测方法)相比，使用本专利技术提供的技术方案测定得到的结果基本不受细胞生理状态的影响，排除了因生理状态变化产生的系统误差，提高了结果的可信度。附图说明附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种藻细胞中岩藻黄素含量的分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/nS1、取若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品；/nS2、通过化学法分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品的提取液中岩藻黄素的含量；/nS3-1、拉曼光谱分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品的提取液中岩藻黄素的特征峰总面积；/nS4-1、建立所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品的提取液中岩藻黄素的特征峰总面积和岩藻黄素的含量的线性回归方程；或者/nS3-2、拉曼光谱分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积；/nS4-2、分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中藻细胞的密度，根据步骤S2得到的岩藻黄素的含量分别计算单个藻细胞中岩藻黄素的含量，并建立所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积和单个藻细胞中岩藻黄素的含量的线性回归方程；/nS5、拉曼光谱测定待测藻细胞样品的提取液或者单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积，根据S4-1或S4-2中得到的所述线性回归方程，计算所述待测藻细胞样品提取液或者单个藻细胞中岩藻黄素的含量，作为所述待测藻细胞中岩藻黄素的含量。/n...

【技术特征摘要】
1.一种藻细胞中岩藻黄素含量的分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、取若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品；
S2、通过化学法分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品的提取液中岩藻黄素的含量；
S3-1、拉曼光谱分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品的提取液中岩藻黄素的特征峰总面积；
S4-1、建立所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品的提取液中岩藻黄素的特征峰总面积和岩藻黄素的含量的线性回归方程；或者
S3-2、拉曼光谱分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积；
S4-2、分别测定所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中藻细胞的密度，根据步骤S2得到的岩藻黄素的含量分别计算单个藻细胞中岩藻黄素的含量，并建立所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品中单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积和单个藻细胞中岩藻黄素的含量的线性回归方程；
S5、拉曼光谱测定待测藻细胞样品的提取液或者单个藻细胞中岩藻黄素的特征峰总面积，根据S4-1或S4-2中得到的所述线性回归方程，计算所述待测藻细胞样品提取液或者单个藻细胞中岩藻黄素的含量，作为所述待测藻细胞中岩藻黄素的含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，在进行步骤S2之前，该方法还包括，对所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品分别进行预处理；
其中，所述预处理的方法包括：分别将所述若干不同岩藻黄素含量的藻细胞样品进行固液分离，得到藻泥，并将所述藻泥重悬在磷酸盐缓冲液或NaCl溶液中；和/或
步骤S5中，在进行拉曼光谱测定前，该方法还包括，对所述待测藻细胞样品进行预处理；
其中，所述预处理的方法包括：将所述待测藻细胞样品进行固液分离，得到藻泥，并将所述藻泥重悬在磷酸盐缓冲液或NaCl溶液中。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，所述化学法...

【专利技术属性】
技术研发人员：林娟，籍月彤，曹黎，吴明灿，徐健，韩丹翔，胡强，
申请(专利权)人：国投生物科技投资有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31