一种食品病原菌沙门氏菌快速检测的试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于生物技术、食品检测领域，具体是一种食品病原菌沙门氏菌快速检测的试剂盒及方法。为建立一种高效、快速、准确且经济的应用PCR

【技术实现步骤摘要】
一种食品病原菌沙门氏菌快速检测的试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物技术、食品检测领域，涉及食品病原菌检测相关的凝胶电泳(DGGE)技术，具体是一种食品病原菌沙门氏菌快速检测的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科中的一个重要菌属。沙门氏菌为革兰氏阴性杆菌，是一种常见的食源性食品病原菌。沙门氏菌属有的专对人类食品病原菌，有的只对动物食品病原菌，也有对人和动物都食品病原菌。目前国际上有2300个以上的血清型，我国已发现200多种。依据菌体O抗原结构的差异，将沙门氏菌分为A、B、C1、C2、D、E1、F等，其中对人类食品病原菌的沙门氏菌仅占少数。沙门氏菌的宿主特异性极弱，既可感染动物也可感染人类，极易引起人类的食物中毒。食品病原菌性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。
[0003]近年来，国内外食品安全形势严峻，有关食品安全事件发生频频，食品安全成了当今世界性公共卫生的热点。如何快速的检测食品中的食品病原菌成为了我们目前一个急需解决的问题。但传统的细菌培养技术试验周期比较长、步骤比较繁琐，在突发公共卫生事件中该技术无法做到高通量快速检测，不能起到有效的监测、预防作用，并且在试验结果的判定方面对检测人员的要求比较高。

技术实现思路

[0004]为建立一种高效、快速、准确且经济的应用PCR
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DGGE技术检测食品食品病原菌沙门氏菌的方法，本专利技术公开了一种基于PCR
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DGGE检测食品病原菌沙门氏菌的试剂盒和检测方法。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0006]本专利技术提供一种用于食品病原菌沙门氏菌的快速检测的引物组及DNA片段，所述引物组包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的引物；所述DNA片段序列如SEQ ID NO：4所示。
[0007]进一步，所述引物组及DNA片段是通过化学合成的核苷酸片段。
[0008]本专利技术提供一种用于食品病原菌沙门氏菌快速检测的试剂盒，包括：上述的引物组和DNA片段，PCR缓冲液，STE缓冲液。
[0009]进一步，所述PCR缓冲液包括5μl 10
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Easy Taq Buffer，4μl 10mmol/L dNTPs，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl Taq酶，1.5μl基因组DNA，36.5μl ddH2O。
[0010]所述STE缓冲液是由0.584g的NaCl、0.12g的Tris和0.37g的EDTA溶解于100ml的双重蒸馏水配制而成的。
[0011]本专利技术还提供一种食品病原菌沙门氏菌的快速检测的方法，包括以下步骤：
[0012]步骤1，提取样品微生物基因组总DNA；
[0013]步骤2，分别以超纯水、化学合成的的DNA片段及样品总DNA为模板进行PCR扩增，超纯水产物作为阴性对照，DNA片段扩增产物作为待测样品的标准；样品PCR扩增产物作为DGGE分析的待测样品；
[0014]步骤3，对标准和待测样品进行DGGE检测；
[0015]步骤4，DGGE检测完毕后，将含有DNA片段及待测样品的凝胶放入2.5
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4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当待测样品条带与标准条带在DGGE凝胶上处于同一水平位置时，说明待测样品为沙门氏菌感染的样品；当待测样品没有条带或条带与标准条带在DGGE凝胶上不处于同一水平位置时，说明测样品没有感染沙门氏菌。
[0016]进一步，所述步骤1中样品微生物基因组总DNA提取的步骤如下：
[0017](1)将样品用STE缓冲液浸泡后，12000rpm离心1mn收集菌体；
[0018](2)用STE缓冲液洗涤菌体，再12000rpm下离心2min获得菌体；
[0019](3)菌体加入STE缓冲液300μl、溶菌酶30μl，吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5h；
[0020](4)加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5h，完成后取出，冷却至室温，加入NaCl 70μl。
[0021](5)加入450μl DNA酚试剂，混匀，12000rpm离心10min，取上清液；
[0022](6)加入等体积的体积比为25：24：1的苯酚
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氯仿
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异戊醇抽提，12000rpm离心10min，取上清液，重复一次；
[0023](7)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀；
[0024](8)用75％乙醇溶液洗涤沉淀，吹洗，静置2分钟后吸出乙醇；
[0025](9)加入40μl的ddH2O、2μl的RNA酶，在55℃下水浴30min。
[0026]所述步骤3中DEGG检测为：选择8％的聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％
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60％，梯度混合制胶；电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μL微量进样器快速上样，上样量为30μl；在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8h。
[0027]与现有技术相比本专利技术具有以下优点：
[0028]本专利技术所建立的基于PCR
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DGGE技术相对于传统方法来说有准确快速的优点，具有一定的理论及实际意义。利用DGGE检测食物中的沙门氏菌，时间短、实验结果准确、可重复、技术易普及，可以批量分析多个样品。与常规培养方法相比，为一种高效、快速、经济、便捷的检测方法。
附图说明
[0029]图1为实施例1的检测结果图。
[0030]图2为实施例2的检测结果图。
[0031]图3为实施例3的检测结果图。
[0032]图中M代表化学合成的沙门氏菌的DNA标准分子片段。
具体实施方式
[0033]下面结合本专利技术实施例和附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以
做出若干变型和改进，这些也应视为属于本专利技术的保护范围。
[0034]实施例1
[0035]1.通过化学合成用于食品病原菌沙门氏菌的快速检测的引物组及DNA片段。
[0036]引物组包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的引物；所述DNA片段为SEQ ID NO：4所示的序列。
[0037]SEQ ID NO：1为：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
[0038]SEQ ID NO：2为：ATT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于食品病原菌沙门氏菌快速检测的引物组及DNA片段，其特征在于，所述引物组包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的引物；所述DNA片段序列如SEQ ID NO：4所示。2.根据权利要求1所述的一种用于食品病原菌沙门氏菌快速检测的引物组及DNA片段，其特征在于：所述引物组及DNA片段是通过化学合成的核苷酸片段。3.一种权利要求1所述的用于食品病原菌沙门氏菌快速检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组和DNA片段，PCR缓冲液，STE缓冲液。4.根据权利要求3所述的一种用于食品病原菌沙门氏菌快速检测的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包括5μl 10
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Easy Taq Buffer，4μl 10mmol/L dNTPs，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl Taq酶，1.5μl基因组DNA，36.5μl ddH2O。5.根据权利要求3所述的一种用于食品病原菌沙门氏菌快速检测的试剂盒，其特征在于：所述STE缓冲液是由0.584g的NaCl、0.12g的Tris和0.37g的EDTA溶解于100ml的双重蒸馏水配制而成的。6.一种权利要求1
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5任一项所述的食品病原菌沙门氏菌的快速检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，提取样品微生物基因组总DNA；步骤2，分别以超纯水、化学合成的DNA片段及样品总DNA为模板进行PCR扩增，超纯水扩增产物作为待测样品的阴性对照，DNA片段扩增产物作为待测样品的标准；样品PCR扩增产物作为DGGE检测的待测样品；步骤3，对标准和待测样品进行DGGE检测；步骤4，DGGE检测完毕后，将含有化学合成的DNA片段及待测样品的凝胶放入2.5
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4S Red Plus染液中染色1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘承芸，杨秀清，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：