一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法及应用，采用无外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到上清液，将上清液差速离心得到外泌体，与天然芳香材料混合制成药物。本发明专利技术所述的制备方法通过培养神经干细胞，高效地从神经干细胞培养上清液中通过差速离心提取到高浓度、高纯度的外泌体，此外，从天然植物香料中提取制作天然芳香材料干粉，制作多种气味的药物，通过鼻粘膜给药，药物通过嗅觉传导通路进入海马等学习记忆相关的脑组织部位，通过动员机体的内源性神经干细胞、建立再生微环境，促进神经损伤修复，用于防治老年痴呆的认知功能障碍、延缓中年记忆减退和提高青少年学习能力。高青少年学习能力。高青少年学习能力。

【技术实现步骤摘要】
度上导致发生痴呆年龄的提前。目前，随着社会进步，各种高科技产品的应 用和工作压力的增加，记忆减退是困扰中年就业人群的重大社会问题。
[0007]当前，对青少年智力发育也逐渐受到关注。在青少年生长发育阶段，通 过本专利技术的神经干细胞外泌体经鼻吸收给药、药物通过嗅觉传导通路进入海 马等学习记忆相关的脑组织部位、动员使用者机体的内源性神经干细胞、提 高学习记忆能力、增强智力很有必要。
[0008]在学习和记忆功能密切相关的脑区，突触和神经元的变性及功能失调是 老年性痴呆和智力障碍的特征。尽管老年性痴呆病因尚不十分清楚，一般认 为与遗传和环境因素有关。迄今为止，老年性痴呆的传统治疗药物包括碱酯 酶抑制剂、神经生长因子、脑细胞活化剂等，主要是改善患者的临床症状， 而不是针对老年性痴呆的发病机制、阻断其病理过程，并不能有效的阻断老 年性痴呆的发展，因而疗效有限。
[0009]目前对内源性脑保护因子如内源性神经干细胞、神经营养因子的基础和 临床应用研究逐渐受到重视。内源性神经干细胞是指来源于机体自身的神经 干细胞，正常情况下处于静息状态。内源性神经干细胞广泛存在于成年哺乳 动物的海马、脑室下区、纹状体、嗅球、室管膜、脉络丛、大脑皮质等区域。 在成人脑内，内源性神经干细胞分布于海马齿状回颗粒下层、侧脑室室管膜 下区、皮质、杏仁核、小脑、纹状体、下丘脑、嗅球和胼胝体下区，其中海 马齿状回颗粒下层和侧脑室下区是成体大脑内源性神经干细胞存在的主要 脑区。侧脑室下区的内源性神经干细胞经吻侧迁移流迁移至嗅球，在此过程 中神经干细胞经过不断增殖、分化、发育为成熟的嗅球中间神经元，并整合 填补入皮质的气味分辨区，参与嗅神经的再生。而海马齿状回颗粒下层的内 源性神经干细胞定向迁移至颗粒细胞层后分化发育为成熟神经元，并整合入 海马神经环路，参与学习和记忆。
[0010]最近研究显示：在成体大鼠、非人灵长类及人类大脑的侧脑室下区和海 马齿状回颗粒下层存在神经干细胞。新生成的细胞在颗粒下层能够分化为成 熟、具有功能的神经元并作为颗粒细胞融入齿状回参与记忆形成。
[0011]神经干细胞最基本的生物学特征是能够自我更新，进行多潜能分化。神 经干细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。例如，内源性 神经干细胞正常情况下处于静息状态，一旦中枢神经系统受到缺血性损伤等 刺激后，海马齿状回颗粒下层和侧脑室下区等区域中的神经干细胞被动员和 激活，在缺血信号的刺激下可以迁移至相应的受损神经区域，进行增殖、分 化以弥补神经元的数量和促进功能恢复，并与周围神经元建立突触联系，修 复受损的神经功能。但是内源性神经干细胞的修复能力有限，不足以抵抗缺 血性脑卒中导致的神经损伤。因而，如何通过动员内源性神经干细胞修复损 伤神经元仍有待进一步探索。
[0012]在老年性痴呆治疗中，可以通过刺激成体大脑室管膜下区和颗粒下层神 经干/祖细胞的增殖，由此产生的新生细胞迁移到受损的大脑区域，在那里他 们表达成熟神经元，以修复老年性痴呆患者损伤的环路并恢复学习和记忆能 力。这些发现推翻了成立于20世纪初的神经细胞不能再生这一“教条”， 这表明用内源性神经干细胞有可能替代死亡或损伤的神经细胞。然而，机体 自我修复的能力显然是不够的。因此，目前学者们正探索运用外源性干预手 段促进内源性神经干细胞的动员、增殖、归巢、迁移、分化等，以期达到有 效治疗老年性痴呆的目标。此外，内源性神经干细胞没有伦理及发生免疫排 斥的优点，应用前
景乐观，但在它们成为有效治疗手段前有许多问题有待克 服。
[0013]目前利用干细胞干预治疗脑梗死后脑组织缺血损伤的方法主要有两种： 一种方法是移植外源性的神经干细胞，将来源于胚胎或成年脑细胞的干细 胞，甚至将胚胎干细胞直接移植到脑受损部位；另一种方法是动员机体内源 性的神经干细胞，是指将位于侧脑室壁的室管膜下区和海马齿状回的颗粒下 区区域内的内源性神经干细胞激活。移植干细胞技术为脑梗死治疗带来了生 机，但由于受到干细胞的来源、伦理、移植排斥反应及潜在的致肿瘤性等因 素的制约，其目前在临床的应用有很大局限性。在这种背景下，国内外的专 家学者提出了一种新的理论，即通过动员机体内源性神经干细胞来治疗脑梗 死疾病。利用一定的外源性趋化因子，包括药物或者神经营养因子等方法和 手段动员内源性神经干细胞的增殖、归巢、迁移、分化和表达，使其最终发 挥神经再生和神经修复的作用，这已经成为内源性神经干细胞的重点研究方 向。

技术实现思路

[0014]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备 方法及应用，以动员机体的内源性神经干细胞，防治老年痴呆的认知功能障 碍、延缓中年记忆减退和提高青少年学习能力。
[0015]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0016]一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，包括以下步骤：
[0017]a.采用无外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到含有神经干细胞外 泌体的培养上清液，将培养上清液差速离心得到外泌体，将外泌体制成外泌 体冻干粉；
[0018]b.将外泌体冻干粉、天然芳香材料干粉及混合介质混合，得到神经干细 胞外泌体经鼻吸收药物。
[0019]优选的，步骤a中神经干细胞的培养方法包括以下步骤：
[0020]a.分离胎脑的前脑及中脑，将前脑及中脑分别研碎后得到研碎产物，以 DMEM培养基在离心管内对研碎产物重悬，吹打均匀后，过滤，得到滤液；
[0021]b.以1500rpm对滤液离心5min，吸弃上层的上清液，加入神经干细胞原 代培养基，混匀并计数；
[0022]c.以3x106‑
5x106cells/mL的浓度将神经干细胞接种于培养瓶中，将培养 瓶至于37℃、5％CO2培养箱中原代培养；
[0023]d.原代培养7天后，每隔2
‑
3天进行半量换液，换液时以1000rpm、5min 离心收集神经干细胞；
[0024]e.当神经干细胞球培养至直径大于0.3mm，进行传代培养，在培养瓶中 加入细胞消化液，在37℃的培养箱中消化5min，吹打消化后的细胞悬液至 细胞悬液内无肉眼可见神经球，对神经干细胞计数；
[0025]f.以3x106‑
5x106cells/mL的浓度将神经干细胞接种于培养瓶中，采用无 外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到神经干细胞培养液。
[0026]优选的，步骤a中差速离心得到外泌体的方法包括以下步骤：
[0027]a.将无外泌体血清培养的神经干细胞上清液(含有神经干细胞外泌体的 培养上清液)放入台式离心机，在4℃温度下以400g以下转速离心15min， 得到离心液；
[0028]b.将离心液在4℃温度下，以10000g以上转速离心15min，得到超滤液；
[0029]c.将超滤液用0.22μm过滤器过滤，得到浓缩液；
[0030]d.将浓缩液在4℃温度下，使用超速离心机，以100000g以上转速离心 90min，弃除上清液得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.采用无外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到含有神经干细胞外泌体的培养上清液，将培养上清液差速离心得到外泌体，将外泌体制成外泌体冻干粉；b.将外泌体冻干粉、天然芳香材料干粉及混合介质混合，得到神经干细胞外泌体经鼻吸收药物。2.根据权利要求1所述的神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，其特征在于，步骤a中神经干细胞的培养方法包括以下步骤：a.分离胎脑的前脑及中脑，将前脑及中脑分别研碎后得到研碎产物，以DMEM培养基在离心管内对研碎产物重悬，吹打均匀后，过滤，得到滤液；b.以1500rpm对滤液离心5min，吸弃上层的上清液，加入神经干细胞原代培养基，混匀并计数；c.以3x106‑
5x106cells/mL的浓度将神经干细胞接种于培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中原代培养；d.原代培养7天后，每隔2
‑
3天进行半量换液，换液时以1000rpm、5min离心收集神经干细胞；e.当神经干细胞球培养至直径大于0.3mm，进行传代培养，在培养瓶中加入细胞消化液，在37℃的培养箱中消化5min，吹打消化后的细胞悬液至细胞悬液内无肉眼可见神经球，对神经干细胞计数；f.以3x106‑
5x106cells/mL的浓度将神经干细胞接种于培养瓶中，采用无外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到含有神经干细胞外泌体的培养上清液。3.根据权利要求1所述的神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，其特征在于，步骤a中差速离心得到外泌体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张平，李栋，
申请(专利权)人：张平，
类型：发明
国别省市：