一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dCTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。本发明专利技术利用生物素标记的DNA探针抓取特异RNA，并随之获取与RNA互作的蛋白与DNA。首先用交联剂将体内互作的RNA、DNA和蛋白交联在一起，再利用与RNA序列互补且标记生物素的DNA探针与交联后的裂解液孵育，之后用链霉亲和素磁珠捕获RNA、DNA、蛋白互作复合物，最后分别洗脱RNA、蛋白以及DNA。

【技术实现步骤摘要】
一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及分子生物领域，尤其涉及一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法背景内容非编码RNA参与细胞增值、迁移，EMT转化，干细胞分化，细胞凋亡等众多细胞进程的调控，是生物体重要的调控因子。非编码RNA主要包括lncRNA、circRNA、microRNA、eRNA等，这些RNA在胞质中的功能已研究的非常深入。近年来，研究表明，大量非编码RNA，尤其是lncRNA和eRNA，通过参与表观遗传过程来调控细胞进程。表观遗传指的是在DNA序列不改变的情况下基因表达发生可遗传变化。主要包括DNA甲基化，甲基化、乙酰化等组蛋白修饰以及染色质重构等。在真核生物中，被研究的最清楚的表观调控过程是干细胞分化过程。该过程通过转录因子调控Nanog、Sox2、Oct2三大核心调控因子，进而招募激活复合物或抑制复合物，从而激活或抑制干性相关基因，从而调控干细胞的分化。许多研究表明，这一调控机制也适用于癌症等多种疾病的研究。近年来。非编码RNA作为一种新兴的表观遗传调控分子，被大量研究。研究结果表明，非编码RNA可以直接缠绕在转录因子上或作为支架调控转录因子，从而调控组蛋白与相关沉默或激活复合物，进而调控基因的转录。非编码RNA与DNA、蛋白的互作是研究RNA参与表观调控的关键。已往的技术是将三者的互作两两分开，先通过RIP或RNApulldown研究RNA与蛋白互作情况，再通过ChIP研究DNA与蛋白互作，最后进行生物统计比较，找到三者互作的蛋白。这种方法既不能统一实验条件，也不能直观的证明三者者的互作，只能通过实验实验推断互作，具有很高的假阳性。很多实验没有阳性对照和阴性对照去评估实验的准确性，实验的可重复性差。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性好、经济、完整的简便检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dUTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。本专利技术利用生物素标记的DNA探针抓取特异RNA，并随之获取与RNA互作的蛋白与DNA。首先用交联剂将体内互作的RNA、DNA和蛋白交联在一起，再利用与RNA序列互补且标记生物素的DNA探针与交联后的裂解液孵育，之后用链霉亲和素磁珠捕获RNA、DNA、蛋白互作复合物，最后分别洗脱RNA、蛋白以及DNA。进一步地，所述检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述的阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’其中TERC探针序列是经过优化的序列，该序列与端粒酶序列互补，且每个序列间隔均匀，间距均在80-100bp之间，探针的GC含量均在45％-55％之间。LacZ为原核生物序列，其探针序列也经过严格优化，选取lacZ序列的中前端序列设计探针，探针间距为200-300bp之间，探针的GC含量均在45％-55％之间。探针数量均为5条，这经过我们严格测定，探针为5条是，捕获效率最高。所述细胞裂解液的配方包括如下原料：1～1.5％(W/V)SDSTris-Cl50～100mmol/LEDTA10～15mmol/LPMSF0.8～1.2mmol/L；所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，可以裂解胞膜，1％左右的SDS可以迅速裂解细胞膜及核膜；Tris-HCl作为一种稳定的缓冲液，可以维持稳定的pH值，pH值为7.2～7.5，与细胞正常PH值(7.4左右)保持一致,保持正常的DNA和蛋白形态；EDTA为乙二胺四乙酸，可以和细胞中Mg2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子络合，抑制细胞内多种酶的活性；PMSF为磷酸酶抑制剂，主要抑制磷酸酶的活性。所述杂交液的配方包括如下原料：1～1.5％(W/V)SDS15～20％(V/V)formamideNaCl500～750mmol/LTris-Cl50～100mmol/LEDTA1～2mmol/LPMSF0.8～1.2mmol/L所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，可以裂解胞膜，1％左右的SDS可以迅速裂解细胞膜；formamide是去离子甲酰胺，它可以与核酸形成氢键，使DNA或RNA的变性，15～20％的去离子甲酰胺可以使游离的RNA保持变性状态，而DNA则保持双链结构保持，使探针与RNA更好的结合。Tris-HCl作为一种缓冲液，可以维持稳定的pH值，pH值为7.2～7.5，与细胞正常PH值(7.4左右)保持一致,保持正常的DNA和蛋白形态；Nacl作为一种电解质，500～750mmol/L的Nacl，是一个高盐状态，高浓度的Na+可以中和核酸上的电性，促进碱基互补配对作用，从而促进探针与RNA的结合；EDTA为乙二胺四乙酸，可以和细胞中Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子络合，抑制细胞内多种酶的活性；PMSF为磷酸酶抑制剂，主要抑制磷酸酶的活性。所述蛋白酶K缓冲液的配方包括如下原料：0.3～0.8％(W/V)SDSNaCl100～150mmol/LTris-Cl10～20mmol/LEDTA1～2mmol/L所述Tris-Cl的PH值为两个范围，提取RNA时，Tris-Cl的PH值为6.5-7.0，提取DNA时，Tris-Cl的PH值为8.0～8.5。其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，0.5％左右的SDS可以使蛋白质变性，从而增强本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dCTP，阳性探针与阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，蛋白酶K及其缓冲液，洗液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dCTP，阳性探针与阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，蛋白酶K及其缓冲液，洗液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。


2.根据权利要求1所述检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述的阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’。


3.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述裂解液的配方包括如下原料：
1～1.5％(W/V)SDS
Tris-Cl50～100mmol/L
EDTA10～15mmol/L
PMSF0.8～1.2mmol/L；
所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。


4.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述杂交液的配方包括如下原料：
1～1.5％(W/V)SDS
15～20％(V/V)formamide
NaCl500～750mmol/L
Tris-Cl50～100mmol/L
EDTA1～2mmol/L
PMSF0.8～1.2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。


5.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K缓冲液的配方包括如下原料：
0.3～0.8％(W/V)SDS
NaCl100～150mmol/L
Tris-Cl10～20mmol/L
EDTA1～2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为两个范围，提取RNA时，Tris-Cl的PH值为7.0～7.5；提取DNA时，Tris-Cl的PH值为8.0～8.5。


6.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述洗液的配方包括如下原料：
0.3～0.8％(W/V)SDS
NaCl300～400mmol/L
柠檬酸钠30～40mmol/L。


7.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述DNA洗脱液的配方包括如下原料：
0.8～1.2％(W/V)SDS
NaHCO350～80m...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：广州赛诚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44