一种构建体外组织工程软骨的方法技术

本发明专利技术涉及一种构建体外组织工程软骨的方法，将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养；软骨仿生支架的平均孔径为100μm以上；阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，且阶梯数量为2以上；每个阶梯对应的静水压力在0.1MPa～10MPa范围内选择，每个阶梯对应的静水压力的持续时间在10s～100s范围内选择，相邻阶梯对应的静水压力相差在1.5倍以上。本发明专利技术结合适当天然蛋白软骨仿生支架的构建及一种阶梯状循环动态静水压刺激培养来构建软骨表型维持良好的体外组织工程软骨，支架材料的力学性能、孔隙率等特征均适合软骨细胞的黏附生长与表型维持，阶梯状循环动态静水压刺激体现出了优秀的促软骨细胞生长与表型维持能力。

【技术实现步骤摘要】
一种构建体外组织工程软骨的方法
本专利技术属于仿生支架
，涉及一种构建体外组织工程软骨的方法，更具体是涉及一种基于软骨仿生支架协同动态静水压培养构建体外组织工程软骨的方法。
技术介绍
软骨中因为缺少血管、淋巴和神经，一旦受损很难自行修复，随着时间的推移，将继发骨性关节炎等疾病。目前临床尚缺乏一种有效的策略来修复或逆转损伤的软骨。近年来，组织工程技术成为了软骨修复的重要发展方向。在软骨组织工程的众多种子细胞中，自体软骨细胞在临床及学术界的应用和研究最为广泛。联合种子细胞、支架材料和细胞因子构建组织工程软骨，为软骨的修复与再生带来了新的希望。然而，软骨细胞来源受限，传统的培养方法导致体外的软骨扩增极易发生去分化而失去软骨表型，最终新生组织以纤维软骨为主，其组织学与生物力学特性明显降低，导致修复失败。因此，如何选择合适的支架材料、恰当的培养条件等来协同构建适宜的细胞生长微环境，最终实现软骨细胞的正常生长与表型维持变得异常重要。从支架材料来看：支架材料作为种子细胞的载体和软骨细胞外基质的临时替代物，理想的状态是能够促进软骨细胞的黏附、增殖和细胞外基质的分泌，进而维持软骨的表型特征，并能随着软骨组织的重建(植入体内后)逐渐降解。当前的支架材料主要包括合成生物材料和天然生物材料，合成材料便于大量生产、力学性能强，但生物相容性相对较差；天然材料总体来讲生物相容性优，但其力学性能相对较弱。丝素蛋白等天然蛋白作为一类特殊的天然材料，既具有来源广泛、便于大量生产的优势，也具有优异的生物相容性、可控的降解性、无免疫源性、优良的加工性等，因而成为了软骨组织工程支架的理想材料之一。然而，纯蛋白软骨支架的孔径小、力学强度低，不利于软骨的长入和生长。研究表明(ACSSustainableChemEng,2020,8,2375-2389)，纯丝素蛋白支架的力学性能可以通过与部分细菌纤维素纤维的复合得到一定程度的改善。从培养条件来看：传统的培养方式一般是在静态培养条件下添加一定量的化学因子，以促进软骨细胞的增殖和表型维持。然而，此类条件诱导或培养获得的软骨细胞易发生肥大或钙化，也较易发生去分化而失去软骨表型，甚至出现大量纤维化软骨。近年来，基底材料的物理特征，如材料的软硬度等也被发现能在一定程度上影响细胞的功能或表型维持。此外，一些动态培养刺激对细胞功能或表型维持的影响也逐渐被揭示。例如，传统培养体系中软骨细胞极易发生去分化，文献报道表明静态静水压培养(MaterialsLett.,2019,246:71-75)和一种正弦波状静水压刺激培养(TissueEng.PT.A,2012,18:1979-1991)均可在一定程度上提升软骨细胞的表型维持，进而部分改善静态培养中遇到的难题。截至目前，体外组织工程软骨制备领域中的支架材料构建及培养条件的优化方面仍有较大提升空间，以最终实现软骨细胞的正常生长与表型维持。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种基于软骨仿生支架协同动态静水压培养构建体外组织工程软骨的方法；本专利技术结合一种天然蛋白力学仿生支架的构建，同时协同一种新颖的阶梯状循环动态静水压刺激培养，可以构建出一种综合性能优异的体外组织工程软骨，有望用于体内软骨缺损修复。本专利技术的一种构建体外组织工程软骨的方法，结合适当天然蛋白软骨仿生支架的构建及一种新颖的阶梯状循环动态静水压刺激培养来构建软骨表型维持良好的体外组织工程软骨。支架材料的力学性能、孔隙率等特征均适合软骨细胞的黏附生长与表型维持，阶梯状循环动态静水压刺激由于兼具软骨仿生刺激特性和较佳的动态变化特性而体现出了优秀的促软骨生长与表型维持能力。利用此复合手段进行体外构建的组织工程软骨在软骨修复领域具有良好的应用前景。为达到上述目的，本专利技术采用的方案如下：一种构建体外组织工程软骨的方法，将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养；软骨仿生支架的平均孔径为100μm以上；阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，且阶梯数量为2以上；每个阶梯对应的静水压力在0.1MPa～10MPa范围内选择，每个阶梯对应的静水压力的持续时间在10s～100s范围内选择，相邻阶梯对应的静水压力相差在1.5倍以上。如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，按支架体积计算，软骨细胞的接种密度为6×106cells/立方厘米以上。如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，刺激培养的总时间为1～8个周期。如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，每个周期的总时间为7天，具体是每天刺激0.5h～2h，持续刺激5天后休息2天。如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，软骨仿生支架的制备过程为：先将纳米纤维束与天然蛋白水溶液混合均匀得到混合液，再向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP溶液，形成交联体系；然后将交联体系置于模具中交联形成水凝胶；最后将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架。为解决现有软骨组织培养构建技术中软骨细胞生长不佳、容易丧失软骨表型维持的问题，本专利技术以具有良好生物相容性的天然蛋白为基体，以纳米纤维束为增强改性体，随后通过化学交联、冷冻干燥工艺的结合制备软骨力学仿生支架。其具体形成和调控机理如下：当将一定浓度配比的天然蛋白水溶液、无毒交联引发剂、纳米纤维束通过外界机械力作用均匀混合处理一段时间，然后将混合物倒入模具中交联成型。交联条件为37℃交联，较为温和，此方案可用于前期在体系中加入具有较高生物活性的生长因子等活性蛋白材料而不破坏其生物活性。交联过程将形成具有良好互通网络的水凝胶体系。由于纳米纤维束在水凝胶体系中的穿插、一方面将提升支架的孔径、另一方面还将提升支架材料的宏观力学强度。高的孔径和孔隙率有利于细胞向支架内部生长及营养物质、代谢废物的交换，进而更适宜于细胞的生长、长入和软骨表型维持。体系交联后将样品放置到低温下冻实，最后将冷冻好的样品置于冷冻干燥机中，使体系中冰晶升华便得到所需的多孔支架。同时，支架构筑所用的丝素蛋白等天然材料具有良好且可调的降解性能，且降解产物无毒、在体内易于代谢排除，因而也满足植入体内修复过程中的降解需求。如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，软骨仿生支架的孔隙率为85％～95％，平均孔径为100～200μm，压缩强度为0.7～1.7MPa，弹性模量为0.4～1.4MPa。本专利技术的软骨仿生支架与天然软骨组织具有良好的力学匹配性，可达到较好的力学性能仿生。如上所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，天然蛋白水溶液的浓度为3～12wt％；混合液中，天然蛋白和纳米纤维束的重量比为95:5；所述天然蛋白为丝素蛋白(SF)、弹性蛋白、明胶和纤维蛋白中的一种以上；H2O2水溶液的浓度为490mM；H2O2水溶液的加入量占交联体系的体积含量的1～6vol％；HRP溶液是将HRP(辣根过氧化物酶)溶于PBS缓冲液中得到，HRP溶液的浓度为1000U/mL；HRP溶液的加入量占交联体系的体积含量的1～6vol％。如上所述的一种构建体外组织工本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征是：将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养；/n软骨仿生支架的平均孔径为100μm以上；/n阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，且阶梯数量为2以上；每个阶梯对应的静水压力在0.1MPa～10MPa范围内选择，每个阶梯对应的静水压力的持续时间在10s～100s范围内选择，相邻阶梯对应的静水压力相差在1.5倍以上。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征是：将软骨细胞接种到软骨仿生支架上，黏附好后施加阶梯状动态静水压刺激培养；
软骨仿生支架的平均孔径为100μm以上；
阶梯状动态静水压是指静水压力随时间呈阶梯状变化，且阶梯数量为2以上；每个阶梯对应的静水压力在0.1MPa～10MPa范围内选择，每个阶梯对应的静水压力的持续时间在10s～100s范围内选择，相邻阶梯对应的静水压力相差在1.5倍以上。


2.根据权利要求1所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，按支架体积计算，软骨细胞的接种密度为6×106cells/立方厘米以上。


3.根据权利要求1所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，刺激培养的总时间为1～8个周期。


4.根据权利要求3所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，每个周期的总时间为7天，具体是每天刺激0.5h～2h，持续刺激5天后休息2天。


5.根据权利要求1所述的一种构建体外组织工程软骨的方法，其特征在于，软骨仿生支架的制备过程为：先将纳米纤维束与天然蛋白水溶液混合均匀得到混合液，再向混合液中依次加入H2O2水溶液和HRP(辣根过氧化物酶)溶液，形成交联体系；然后将交联体系置于模具中交联形成水凝胶；最后将水凝胶采用冷冻干燥工艺制得软骨仿生支架...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚响，张耀鹏，谷敏婧，范苏娜，
申请(专利权)人：东华大学，济南金泉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31