一种木麻黄的种质资源离体保存方法技术

本发明专利技术公开了一种木麻黄的种质资源离体保存方法，以木麻黄植株幼嫩木质化枝条作为外植体，将木麻黄枝条彻底清洗干净，然后进行灭菌，从灭菌后的木麻黄枝条切取1‑3cm茎段，接入启动培养基中进行启动培养，5‑30天后转到扩繁培养基中进行扩繁培养10‑30天，然后转入保存培养基中于温度1‑15℃和光照200‑1000Lux条件下进行保存；本发明专利技术提出的木麻黄的种质资源离体保存方法建立了木麻黄种质资源保存的无菌体系，采取组织培养，有效脱除潜伏在木麻黄中病毒性病害，实现真正无病害种质资源保存，具有遗传性状稳定，培养过程简单，保证了种质基因的完全保留。

【技术实现步骤摘要】
一种木麻黄的种质资源离体保存方法
本专利技术涉及组织培养与种质资源保存
，具体涉及一种木麻黄的种质资源离体保存方法。
技术介绍
木麻黄属于木麻黄科，为常绿乔木，具有耐干旱、耐瘠薄、耐盐碱、固氮改土、防风、固沙、速生等特性，被广泛用于防风固沙、盐碱地改良和干旱区造林，是我国南方贫瘠的沿海沙地、严重退化的丘陵地区的造林先锋树种，在沿海防护林中占有重要地位，具有巨大的生态经济价值。目前木麻黄种质资源保存方法通常是以种子园或种源试验林的形式进行种质保存，繁殖技术有种子繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖等。以种子繁殖为种质进行资源保存的技术难以完全保留优良木麻黄树种基因；而以插条繁殖的种质进行资源保存的方法工作量大，劳动强度高成本不易控制，且该技术在有些木麻黄树种不太容易实现，比如山地木麻黄、滨海木麻黄和森林木麻黄等。受木麻黄树种本身形态特征的客观影响，嫁接繁殖在不同木麻黄树种之间成活率差异较大，枝条较粗的粗枝木麻黄嫁接成活率较高，枝条较细软的短枝木麻黄、细枝木麻黄和山地木麻黄嫁接成活率较低。且受嫁接工人技术水平的影响较大，令种质资源保存稳定性和效率大打折扣。此外，上述传统方法均不能对木麻黄种质资源进行脱除病毒保存，以至于一些引起植物病害的病毒、类菌质体和类病毒等病原微生物随种质资源一同保存下来，可能会为日后种质资源的大量繁殖及应用于造林带来毁灭性的灾难。由于林木种质资源保存是实现林业可持续发展的重要组成部分，做好、做细林木种质保存工作，使林业优良种质资源得到有效保存，直接关系到人工林产量持续提高与抗逆性品种的发展。因此，利用木麻黄的种质资源离体保存的方法，使其能脱除病毒保存，保存的资源种植后遭除植物病害的侵害，真正实现“高产、优质、稳定、高效”的目的具有重要意义。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种木麻黄的种质资源离体保存方法，不仅使目标木麻黄品系种质资源基因得以完整保留，而且保存材料能够脱除病毒，令日后保存的资源大范围运用时避免植物病害的发生。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种木麻黄的种质资源离体保存方法，包括以下步骤：(1)培养基的配制：包括基本培养基和离体各阶段的培养基：a)MS培养基：每升MS培养基中含有无机添加物KNO31650-2150mg、NH4NO31420-1740mg、MgSO4·7H2O295-382mg、KH2PO4156-183mg、CaCl2·2H2O367-428mg、Na2-EDTA·2H2O32.6-42.50mg、FeSO4·7H2O28.67-40.22mg、FeSO4·4H2O19.80-32.43mg、MnSO4·H2O13.64-19.75mg、MnSO4·4H2O18.74-27.75mg、ZnSO4·7H2O6.88-10.32mg、H2BO35.96-7.24mg、KI0.66-0.96mg、Na2MoO4·2H2O0.20-0.30mg、CuSO4·5H2O0.020-0.033mg、CoCl2·6H2O0.020-0.035mg，含有有机添加物肌醇80-120mg、烟酸0.4-0.6mg、甘氨酸1.8-2.5mg、盐酸吡哆醇B60.4-0.6mg和盐酸硫胺素B10.08-0.12mg；b)启动培养基：包括MS+6-BA1-3mg/L+NAA0.01-0.5mg/L+蔗糖20-50g/L+植物凝胶3g/L,PH值为5.6-6.0；c)扩繁培养基：包括MS+6-BA0.2-0.8mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+蔗糖10-40g/L+植物凝胶2-5g/L,PH值为5.6-6.0；d)保存培养基：包括1/4MS+多效唑0.05-0.5mg/L+6-BA0.1-0.5mg/L+蔗糖10-50g/L+植物凝胶1.5-5.5g/L,PH值为5.6-6.0；(2)清洗和灭菌：将木麻黄枝条彻底清洗干净，然后进行灭菌；(3)离体培养：从灭菌后的木麻黄枝条切取1-3cm长带腋芽的茎段，接入启动培养基中进行启动培养，5-30天后转到扩繁培养基中进行扩繁培养10-30天，再转入保存培养基中；(4)离体保存：将转入试管苗的保存培养基于低温1-15℃和光照200-1000Lux条件下进行保存，每天光照2-12h。进一步的，所述的木麻黄枝条取自两年生以上木麻黄植株的基部萌蘖枝。进一步的，所述的灭菌过程包括分别用质量浓度为50-80％的乙醇、0.2-0.5％的苯扎溴铵、1-4％的次氯酸钠依次浸泡灭菌10-60s、5-30min、5-20min，无菌水冲洗2-5次，再用0.1-0.5％的氯化汞灭菌3-10min，无菌水冲洗3-5次。进一步的，所述的灭菌过程包括分别用质量浓度为70％的乙醇、0.3％的苯扎溴铵、3％的次氯酸钠依次浸泡灭菌10-60s、5-30min、5-20min，无菌水冲洗2-5次，再用0.3％的氯化汞灭菌3-10min，无菌水冲洗3-5次。进一步的，所述的茎段为选自顶芽或带有腋芽的茎段。进一步的，所述1/4MS培养基是大量元素为MS配方量的1/4。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1)在本专利技术的保存培养基中加入生长抑制剂多效唑0.2mg/L以减缓木麻黄瓶内苗的生长达到长期保存种质材料的目的，实现瓶苗保存9个月后存活率仍为95％，且植株生长正常，与常规正常培养基上的瓶苗仅能存活3个月相比，大大延长了继代培养时间，使继代间隔由平时的1-2个月继代1次转为9个月继代1次，有效防止普通的传代保存法由于多次传代后造成的种性退化及病毒感染，保证种质的优良性和纯洁性；2)由于引起病毒病的微生物在植物体内的活动主要是通过植物的输导组织，而在茎尖的分生组织尚未形成输导组织，微生物在其生活细胞之间传播是很难进行的，加上顶端分生组织不断分裂，因此在该专利技术方法在离体保存中，避开了脱分化形成愈伤组织的组培路子而采取顶芽或腋芽萌动分化成芽丛后继代繁殖，在木麻黄组织培养应用中属于首创，具有遗传性状稳定，培养过程简单，保证了种质基因的完全保留；3)该专利技术方法技术的运用可随时提供材料，工作量小，同时具有节省储存空间，便于运输和种质资源交换扩大利用等优点，克服了木麻黄传统田间种质资源保存方法所面临的子代基因差异大，病虫害易发生、保存效率低下等问题，从外植体开始建立木麻黄种质资源保存的无菌技术，操作切实可行。具体实施方式以下通过具体的实施例，对本专利技术技术方案的具体实施方式进行进一步描述，这些实施例是为了对本技术方案的详细描述，而不是为了限制本技术方案。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例本实施例选用两年生以上木麻黄植株幼嫩木质化枝条的基部萌蘖枝条作为外植体。一种木麻黄的种质资源离体保存方法，包括以下步骤：1)将木麻黄枝条用毛刷沾洗衣粉在流水状态下进行彻底清洗，洗干净之后，分别用70％乙醇、0.3％新洁尔苯扎溴铵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木麻黄的种质资源离体保存方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)培养基的配制：包括基本培养基和离体各阶段的培养基：/na)MS培养基：每升MS培养基中含有无机添加物KNO

【技术特征摘要】
1.一种木麻黄的种质资源离体保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养基的配制：包括基本培养基和离体各阶段的培养基：
a)MS培养基：每升MS培养基中含有无机添加物KNO31650-2150mg、NH4NO31420-1740mg、MgSO4·7H2O295-382mg、KH2PO4156-183mg、CaCl2·2H2O367-428mg、Na2-EDTA·2H2O32.6-42.50mg、FeSO4·7H2O28.67-40.22mg、FeSO4·4H2O19.80-32.43mg、MnSO4·H2O13.64-19.75mg、MnSO4·4H2O18.74-27.75mg、ZnSO4·7H2O6.88-10.32mg、H2BO35.96-7.24mg、KI0.66-0.96mg、Na2MoO4·2H2O0.20-0.30mg、CuSO4·5H2O0.020-0.033mg、CoCl2·6H2O0.020-0.035mg，含有有机添加物肌醇80-120mg、烟酸0.4-0.6mg、甘氨酸1.8-2.5mg、盐酸吡哆醇B60.4-0.6mg和盐酸硫胺素B10.08-0.12mg；
b)启动培养基：包括MS+6-BA1-3mg/L+NAA0.01-0.5mg/L+蔗糖20-50g/L+植物凝胶3g/L,PH值为5.6-6.0；
c)扩繁培养基：包括MS+6-BA0.2-0.8mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+蔗糖10-40g/L+植物凝胶2-5g/L,PH值为5.6-6.0；
d)保存培养基：包括1/4MS+多效唑0.05-0.5mg/L+6-BA0.1-0.5mg/L+蔗糖10-50g/L+植物凝胶1...

【专利技术属性】
技术研发人员：容世清，罗建华，吴章丽，曾少玲，黄良宙，李天卓，余正国，梁庆华，
申请(专利权)人：湛江市林业科学研究所广东省湛江区域性林业试验中心，湛江市林业科技推广中心，
类型：发明
国别省市：广东;44