一种具有除草作用的短梗霉素及其制备方法、测定方法技术

本发明专利技术属于除草剂制备技术领域，公开了一种具有除草作用的短梗霉素及其制备方法，利用出芽短梗霉菌PA‑2制备孢子悬浮液，接种于种子培养基中进行活化，转入到发酵罐中进行发酵；从温度、装液量、培养时间和转速4个方面对培养条件进行优化；取发酵液，弃去菌体，利用大孔树脂进行振荡吸附，对吸附后的树脂进行清洗，洗脱后减压干燥，即为出芽短梗霉菌PA‑2的短梗霉素粗提物；短梗霉素的分离纯化。本发明专利技术提供的具有除草作用的短梗霉素具有较强的耐热性，耐受pH值广泛，对蛋白酶不敏感，该化合物抑制种子萌发时期α‑淀粉酶活性，同时抑制乙酰乳酸酶活性，进而抑制种子的萌发和杂草的生长，达到除草的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种具有除草作用的短梗霉素及其制备方法、测定方法
本专利技术属于除草剂制备
，尤其涉及一种具有除草作用的短梗霉素及其制备方法、测定方法。
技术介绍
目前：杂草是危害农业生产的一个重要因素，通过与作物竞争水分、养分和光照等生长必须条件造成作物的产量和质量受到严重影响。现阶段我国农田杂草治理仍以化学除草为主，每年投入防治费用235亿元，仍然导致粮食减产5000万t，直接经济损失千亿元。农业效率的增高很大程度上仍然依赖于化学除草剂的应用，因此开发新型高效、环境友好的绿色除草剂具有重要的现实意义。近年来，微生物源除草剂由于其对环境的副作用小和易降解等优点，逐渐进入了人们的视线，并成为绿色农业和放心农产品理念下的主要趋势。短梗霉素是出芽短梗霉菌产生的环肽类抗生素，表现出很强的抗菌活性，主要是由于该抗生素能强烈抑制真菌肌醇磷脂酰神经酰胺合成酶的活性，导致鞘磷脂类物质的合成不足，细胞膜结构遭到破坏，细胞内物质外渗，导致真菌死亡。因此，该抗生素在农业和食品方面常常被用作生防制剂和保鲜剂。然而到目前为止，关于对短梗霉素的除草活性方面的应用及其除草机制方面的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有除草作用的短梗霉素的制备方法，其特征在于，所述具有除草作用的短梗霉素的制备方法包括：/n步骤一，菌株活化与发酵：利用出芽短梗霉菌PA-2制备孢子悬浮液，接种于种子培养基中进行活化，转入到发酵罐中进行发酵；/n步骤二，发酵生产优化：从温度、装液量、培养时间和转速4个方面对培养条件进行优化；/n步骤三，短梗霉素的粗提物制备：取发酵液，弃去菌体，利用大孔树脂进行振荡吸附，对吸附后的树脂进行清洗，洗脱后减压干燥，即为出芽短梗霉菌PA-2的短梗霉素粗提物；/n步骤四，短梗霉素的分离纯化：通过薄层层析初步分离，得到短梗霉素产物样品，然后通过高效液相色谱分析对样品进行处理，得到短梗霉素纯品。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有除草作用的短梗霉素的制备方法，其特征在于，所述具有除草作用的短梗霉素的制备方法包括：
步骤一，菌株活化与发酵：利用出芽短梗霉菌PA-2制备孢子悬浮液，接种于种子培养基中进行活化，转入到发酵罐中进行发酵；
步骤二，发酵生产优化：从温度、装液量、培养时间和转速4个方面对培养条件进行优化；
步骤三，短梗霉素的粗提物制备：取发酵液，弃去菌体，利用大孔树脂进行振荡吸附，对吸附后的树脂进行清洗，洗脱后减压干燥，即为出芽短梗霉菌PA-2的短梗霉素粗提物；
步骤四，短梗霉素的分离纯化：通过薄层层析初步分离，得到短梗霉素产物样品，然后通过高效液相色谱分析对样品进行处理，得到短梗霉素纯品。


2.如权利要求1所述的具有除草作用的短梗霉素的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述菌株活化与发酵具体包括：
(1)取-80℃甘油保藏菌株PA-2放置于冰浴器中，待甘油成融化状态时，在超净工作台中倒掉甘油，挖取一块菌苔置于马铃薯葡萄糖固体培养基中，25℃培养基3～5d，刮取菌落表面，制备孢子悬浮液；
(2)将5mL孢子悬浮液接种于150mL的种子培养基中，25℃、180r/m振荡培养2d进行活化；
(3)将150mL种子培养基转入到含有15L发酵培养基A的30L发酵罐中，在25℃、180r/m条件下振荡培养56h，然后加入2L发酵培养基B，在25℃、180r/m条件下，振荡培养88h，获得发酵液。


3.如权利要求2所述的具有除草作用的短梗霉素的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括0.67％yeastnitrogenbase和2％glucose，所述马铃薯葡萄糖固体培养基包括2％potato、2％glucose和1.5％agar；
所述发酵培养基A包括4％glucose、3％skimmilk、3％soybeanflour、0.5％(NH4)2SO4、0.15％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O、0.01％CaCl2·2H2O、0.01％NaCl、0.5μg/mLFeCl3·6H2O和0.5μg/mLZnSO4·7H2O；所述发酵培养基B包括10％glucose、5％polypepton、0.75％KH2PO4、0.25％MgSO4·7H2O、0.05％CaCl2·2H2O、0.05％NaCl、2.5μg/mLFeCl3·6H2O和2.5μg/mLZnSO4·7H2O。


4.如权利要求1所述的具有除草作用的短梗霉素的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述短梗霉素的粗提物制备具体包括：
取发酵液30L，10000r/m离心，弃去菌体，加入3％的大孔树脂XAD-16，室温置于摇床振荡，120r/m，24h；吸附后的树脂用蒸馏水清洗至树脂表面无发酵液残留，然后置于1000mL具塞三角瓶中，加入300mL无水乙醇，室温下，置于摇床洗脱24h，然后减压干燥，即为出芽短梗霉菌PA-2的短梗霉素粗提物。


5.如权利要求1所述的具有除草作用的短梗霉素的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述短梗霉素的分离纯化具体包括：
(1)薄层层析初步分离：采用硅胶板作为层析固定相，层析试剂为二氯甲烷∶甲醇∶水＝65∶25∶4，首先分别将粗提物以及短梗霉素标准样品溶解在少量的甲醇中，点样于硅胶板上进行层析，粗提物各点两块板，在层析系统中展开2h，挥发干试剂后，其中一块以茚三酮显色，另一块放在耐高温的密闭容器中，以小杯盛约2mL浓盐酸，将其放入110℃烘箱中熏蒸3h进行原位水解，然后冷却、吹去盐酸，用茚三酮显色，在放入110℃烘箱中熏蒸1h观察结果，确认短梗霉素的位置；取同样条件薄层层析后的分析板，在与对应显色位点刮取硅胶并收集硅胶粉末，用甲醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：程亮，魏有海，郭青云，朱海霞，翁华，郭良芝，
申请(专利权)人：青海省农林科学院，
类型：发明
国别省市：青海;63