一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法，包括如下步骤：S1.制备目标抗原并采用目标抗原对动物进行免疫；S2.免疫完成后取动物脾脏，采用流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞，制成单细胞悬液；S3.将单细胞的mRNA进行扩增逆转录合成cDNA，扩增抗体重链和轻链的可变区，分别连接至载体；S4.进行细胞转染，即得到单克隆抗体稳转表达细胞株。由本发明专利技术方法制备得到的细胞株相较于传统的杂交瘤细胞株稳定，并且分泌的抗体的批次间生产稳定，产量比杂交瘤细胞株高10‑50倍以上，能广泛应用工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法
本专利技术涉及单克隆抗体制备
，具体涉及一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法。
技术介绍
传统的单克隆抗体制备方法是通过抗原免疫小鼠或兔子等动物体后，通过将脾脏B细胞与肿瘤细胞(S/p20)融合后进行单细胞筛选，进而获取具有分泌针对目标抗原的杂交瘤细胞。该传统的方法的缺陷在于：(1)由于B细胞和肿瘤细胞的融合转化率并不是100％，所以融合过程中很多可以识别目标抗原的B细胞由于融合失败，无法通过上述方法获得这些克隆；(2)杂交瘤细胞本身较不稳定，不同的杂交瘤细胞的抗体表达量差异很大，传代多次后容易丢失目标抗体；(3)合成杂交瘤细胞后进行单克隆的目标抗体筛选会耗费大量的人工，而且一定程度上是否能够获得针对目标抗原的杂交瘤细胞取决于运气，传统方法获得阳性克隆的成功率不高。综上，传统方法一直存在着融合效率低、随机性大，实验过程中阳性率较低，需要多次细胞融合，从而增大了工作量；此外，杂交瘤细胞体内培养需要借助实验动物完成，实验动物培养成本高，而且动物个体差异大容易导致批间差，不利于工业化生产。因此，需要开发一种能稳定获得大量单克隆抗体的新方法。在近几年的单克隆抗体制备方法中，有报道采用免疫原对一种动物进行免疫，获得脾脏B细胞后，进行后续稳转细胞株和单抗的制备。例如专利CN110655576A公开了一种IL-6重组单克隆抗体及其制备方法和应用，其制备方法包括如下步骤：以IL-6免疫小鼠，免疫完成后取小鼠的脾脏，制成单细胞悬液；通过流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞；对所得细胞进行分别培养，再将所得培养物上清液加入到包被IL-6的培养装置继续培养，检测出分泌特异性抗体的细胞株，筛选出可以特异性识别抗原蛋白的抗体克隆；对所得细胞株进行总RNA的抽提，并反转录成cDNA，扩增抗体重链和轻链的可变区，分别连接至载体；然后进行细胞(CHO细胞)转染，生产IL-6重组单克隆抗体。又例如专利CN111995683A公开了一种抗PD-L1蛋白单克隆抗体、细胞株及其制备方法和应用，该抗体的制备方法包括以下步骤：免疫原制备、免疫实验兔、构建抗体cDNA文库并筛选、噬菌体单链抗体库筛选得到可变区序列、构建表达PDL1的CHO细胞株并筛选、细胞株大量生产单克隆抗体。虽然以上两种方法都获得了稳定表达相应单克隆抗体的细胞株，但由于前期采用的均是一种免疫原免疫一种动物，因此获得的脾脏B细胞种类较少，获得目标抗原抗体的成功率也较低。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术要解决的技术问题是一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法，由本专利技术方法制备得到的细胞株相较于传统的杂交瘤细胞株稳定，并且分泌的抗体的批次间生产稳定，产量比杂交瘤细胞株高10-50倍以上。为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法，包括如下步骤：S1.制备目标抗原并采用目标抗原对动物进行免疫；S2.免疫完成后取动物脾脏，采用流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞，制成单细胞悬液；S3.将单细胞的mRNA进行扩增逆转录合成cDNA，扩增抗体重链和轻链的可变区，分别连接至载体；S4.进行细胞转染，即得到单克隆抗体稳转表达细胞株。优选地，步骤S1中所述的目标抗原包括但不限于人IL6、IL2、CD3、CD4或CD8蛋白中的任意一种。更优选地，步骤S1中所述的目标抗原为人IL6或IL2蛋白；所述的人IL6蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；所述的人IL2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。具体地，人IL6蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:1)：人IL2蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:2)：优选地，步骤S1中所述的动物包括但不限于大鼠、小鼠、兔子、羊和/或猴子中的任意一种或多种。更优选地，所述的动物为大鼠、小鼠和兔子。优选地，步骤S2中是利用抗CD8、CD4、F4/80、Gr1、CD38、B220、IgM、IgG1、PE-antigen的抗体进行细胞表面抗体标记，通过流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞。优选地，步骤S3中所述的抗体重链和轻链的可变区的核苷酸序列为经过PCRMixI引物扩增的序列片段。优选地，步骤S4中所述的细胞转染，是对CHO细胞进行转染。优选地，步骤S4中进行细胞转染后，进行稳转细胞株的筛选，以获得高表达单克隆抗体的细胞株。另一方面，本专利技术还提供了上述方法制备得到的细胞株在制备免疫诊断制剂中的应用。相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：(1)相比于传统的杂交瘤细胞合成方法主要获取浆细胞的分泌型抗体，本专利技术方法在采用免疫原免疫不同动物，获得不同动物的脾脏B细胞后，既获得了浆细胞(plasmaB细胞)的分泌型抗体，也获得了记忆性B细胞(memoryB细胞)在细胞表面的抗体，单次免疫可获得高达50个不同的克隆，传统的杂交瘤方法单次免疫只能获得10个以下不同的克隆号。(2)本专利技术方法在获得单个B细胞后，直接扩增单个B细胞的mRNA，无需对B细胞进行体外培养及扩增，操作简便，提高了获得稳定高表达CHO细胞株的成功率。(3)由本专利技术方法制备得到的细胞株相较于传统的杂交瘤细胞株稳定，并且分泌的抗体的批次间生产稳定，产量比杂交瘤细胞株高上百倍，能广泛应用工业化生产。附图说明图1为CHO细胞或杂交瘤细胞分泌纯化的10μg抗人IL6抗体上样SDSPage的结果。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本专利技术，仅用于说明本专利技术。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法，包括如下步骤：1、抗原(免疫原)获得人IL6重组蛋白抗原购买自Invitrogen(ThermoScientific)。2、用免疫原对小鼠、大鼠、兔子进行免疫(1)Balb/c小鼠与大鼠免疫剂量：免疫剂量为100μg/只小(大)鼠，免疫周期为14天，首次背部皮下多点免疫，其后3次免疫为腹腔注射，最后一针尾静脉加强免疫；免疫佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(均购自Sigma公司)。(2)兔子免疫剂量：选择月龄3个月体重1.5kg的大耳白兔，饲养于标准动物房内，连续观察三天，确定情况正常后进行免疫。采用背部多点皮下注射和肌肉注射法进行免疫。具体程序如下：第一天，初次免疫，为更好地刺激实验动物产生免疫反应，采用弗氏完全佐剂乳化免疫原，每只剂量1mg免疫原(溶于1ml生理盐水和1ml弗氏完全佐剂中)；第14天，加强免疫，每只剂量0.5mg免疫原(溶于0.5ml生理盐水和0.5ml弗氏不完全佐剂中)；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.制备目标抗原并采用目标抗原对动物进行免疫；/nS2.免疫完成后取动物脾脏，采用流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞，制成单细胞悬液；/nS3.将单细胞的mRNA进行扩增逆转录合成cDNA，扩增抗体重链和轻链的可变区，分别连接至载体；/nS4.进行细胞转染，即得到单克隆抗体稳转表达细胞株。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备目标抗原并采用目标抗原对动物进行免疫；
S2.免疫完成后取动物脾脏，采用流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞，制成单细胞悬液；
S3.将单细胞的mRNA进行扩增逆转录合成cDNA，扩增抗体重链和轻链的可变区，分别连接至载体；
S4.进行细胞转染，即得到单克隆抗体稳转表达细胞株。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述的目标抗原为人IL6、IL2、CD3、CD4或CD8蛋白中的任意一种。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述的目标抗原为人IL6或IL2蛋白；所述的人IL6蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；所述的人IL2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述的动物为大鼠、小鼠、兔子、羊和/或猴子...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洋，黄爽茹，
申请(专利权)人：浙江正熙生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33