使用组成性高亲和力阳离子外排蛋白减少烟草中亚硝胺含量的方法技术

本发明专利技术涉及减少烟草中的至少一种烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体的含量的方法，其包括在烟草植物或其植物部分或植物细胞中表达去调控的阳离子外排蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用组成性高亲和力阳离子外排蛋白减少烟草中亚硝胺含量的方法专利
本专利技术涉及减少烟草以及由其衍生的产物（例如繁殖材料、收获叶片、加工烟草和烟草工业产品）中的特有亚硝胺或其前体。特别地，本专利技术涉及阳离子外排蛋白及其在调节（例如减少）烟草中的特有亚硝胺或其前体中的用途。背景烟草吡啶类生物碱是烟草特有亚硝胺（TSNA）的前体，所述TSNA在收获后的叶片烤制过程中形成。烤制烟叶中发现的四种主要TSNA是N'-亚硝基降烟碱（NNN）、N'-亚硝基新烟草碱（NAT）、N'-亚硝基新烟碱（NAB）和4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）。当一氧化氮种类（例如NO、NO2、N2O3和N2O4）与烟草生物碱反应时，形成TSNA（图1）。NAT和NAB分别经由次级生物碱新烟草碱和新烟碱的亚硝化形成。尽管早期研究声称NNN源于尼古丁和降烟碱两者，但最近的报道已证实，烤制烟叶中NNN的出现与降烟碱含量而不是尼古丁相关联（Bush等人，Rec.Adv.Tob.Sci.27；23-46（2001）；Lewis等人，PlantBiotechJ.6:346-354（2008））。降烟碱是尼古丁的脱甲基化衍生物，所述尼古丁是烟草中的主要生物碱，占总生物碱含量的90%（Saitoh等人，1985Phytochemistry，24，第477-480页）。NNK形成的前体/产物关系较不明确。一些研究指出NNK是尼古丁的亚硝化产物，但由于尼古丁亚硝化的反应速率较慢，因此很可能尼古丁的氧化衍生物而不是尼古丁本身充当NNK的直接前体（Caldwell等人Ann.N.Y.Acad.Sci.686，213-228（1993））。鉴定负责TSNA前体的产生和调控的基因具有高度重要性。尽管降烟碱通常仅占烟草植物中的总吡啶类生物碱含量的2-4%，但导致高降烟碱含量转换植物的自发出现的遗传不稳定性是烟草生产中的长期问题。维持低降烟碱水平可以防止与该生物碱相关的令人讨厌的风味和香气，以及减少烟草工业产品中降烟碱为其直接前体的N-亚硝基降烟碱（NNN）形成。负责大部分尼古丁至降烟碱转换的基因是尼古丁脱甲基酶基因CYP82E4，其编码细胞色素P450单加氧酶（Siminszky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102（2005），第14919-14924页；Xu等人，Physiol.Plantarum，129（2007），第307-319页）。烟草中的尼古丁脱甲基酶基因家族被广泛表征，但关于可以影响降烟碱水平的其它细胞过程知之甚少。仍然非常需要设计可以进一步减少烟草植物以及由烟草植物产生的产物中的TSNA水平的方法。阳离子外排蛋白是从细胞中去除金属离子如镉（Cd）、锌（Zn）和钴（Co）的泵。这些金属不仅是植物代谢的必需微量营养素，它们还充当第二信使，影响几种酶促反应和信号转导级联。Co、Cd和Zn增加小鼠中的N-脱甲基酶的活性、细胞色素P-450和微粒体血红素的含量（Kadiiska等人E.ArchToxicol（1985）56:167）。提议这些阳离子对肝单加氧酶发挥酶诱导作用。阳离子外排蛋白通常包括经常含有金属结合位点的N末端细胞质结构域，4-6个跨膜结构域，随后为C末端阳离子外排结构域。提议通过与中央细胞质结构域中的关键金属结合残基相互作用，N末端细胞质结构域显示出蛋白质的负调控，阻止了金属转运。当细胞中的金属浓度增加到某一阈值时，金属与N末端结构域的结合诱导构象变化，其放松对细胞质结合位点的抑制。阳离子外排变为高亲和力状态，并且允许金属转运（Futai等人，HandbookofATPases:Biochemistry，CellBiology，Pathophysiology2004）。专利技术概述根据一个方面，本专利技术提供了减少烟草中的至少一种烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体的含量的方法，其包括在烟草植物或其植物部分或植物细胞中表达去调控的阳离子外排蛋白。去调控的阳离子外排蛋白可以是组成性高亲和力阳离子外排转运蛋白。与野生型阳离子外排转运蛋白相比，去调控的阳离子外排蛋白可以显示出增加的金属离子转运。去调控的阳离子外排蛋白可以缺乏功能性调控结构域，优选地，去调控的阳离子外排蛋白缺乏调控结构域的至少一部分。去调控的阳离子外排蛋白可以缺乏功能性细胞质结构域，优选地，去调控的阳离子外排蛋白缺乏细胞质结构域的至少一部分。当与包含如SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30所示的氨基酸序列，或者与其具有至少70%同一性的序列的野生型阳离子外排蛋白相比较时，去调控的阳离子外排转运蛋白可以是去调控的。与如SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30所示的氨基酸序列，或者与其具有至少70%同一性的序列相比，去调控的阳离子外排转运蛋白可以包含一个或多个突变。该方法可以包括将编码阳离子外排蛋白的多核苷酸内的突变引入所述植物或植物细胞的基因组内，使得该多核苷酸编码去调控的阳离子外排蛋白。引入植物基因组的突变可以在编码所述蛋白质的多核苷酸中产生缺失、剪接突变体或编码非耐受性氨基酸取代的密码子。当与如SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30所示的氨基酸序列，或者与其具有至少70%同一性的序列相比较时，去调控的阳离子外排蛋白可以包含缺乏N末端的至少一部分的氨基酸序列。该方法可以包括将外源多核苷酸序列引入所述植物或植物细胞的基因组内，所述外源多核苷酸序列编码去调控的阳离子外排蛋白。去调控的阳离子外排蛋白可以是：a）截短的阳离子外排蛋白，其至少缺乏对应于来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的N末端侧的2-25、或2-50、或2-75、或2-100、2-114、2-117、2-120、2-125、2-128、或2-130的氨基酸，或者与截短的蛋白质具有至少70%（优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%）序列同一性的蛋白质，所述截短的蛋白质至少缺乏对应于SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的氨基酸2-25、或2-50、或2-75、或2-100、2-114或2-117的氨基酸；b）截短的阳离子外排蛋白，其基本上由以下组成或由以下组成：来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的C末端的至少375、至少350、或至少300、或至少250、或至少200、或至少150个氨基酸，或者与截短的蛋白质具有至少70%（优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%）序列同一性的蛋白质，所述截短的蛋白质基本上由以下组成或由以下组成：来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的C末端的至少375、至少350、或至少300、或至少250、或至少200、或至少150个氨基酸。TSNA是N'-亚硝基降烟碱（NNN）和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种减少烟草中的至少一种烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体的含量的方法，其包括在烟草植物或其植物部分或植物细胞中表达去调控的阳离子外排蛋白。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180802 GB 1812603.71.一种减少烟草中的至少一种烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体的含量的方法，其包括在烟草植物或其植物部分或植物细胞中表达去调控的阳离子外排蛋白。


2.根据权利要求1的方法，其中所述去调控的阳离子外排蛋白是组成性高亲和力阳离子外排转运蛋白。


3.根据任一前述权利要求的方法，其中与野生型阳离子外排转运蛋白相比，所述去调控的阳离子外排蛋白显示出增加的金属离子转运。


4.根据任一前述权利要求的方法，其中所述去调控的阳离子外排蛋白缺乏功能性调控结构域，优选地，所述去调控的阳离子外排蛋白缺乏调控结构域的至少一部分。


5.根据任一前述权利要求的方法，其中所述去调控的阳离子外排蛋白缺乏功能性细胞质结构域，优选地，所述去调控的阳离子外排蛋白缺乏细胞质结构域的至少一部分。


6.根据任一前述权利要求的方法，其中当与包含如SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30所示的氨基酸序列，或者与其具有至少70%同一性的序列的野生型阳离子外排蛋白相比较时，所述去调控的阳离子外排转运蛋白是去调控的。


7.根据任一前述权利要求的方法，其中与如SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30所示的氨基酸序列，或者与其具有至少70%同一性的序列相比，所述去调控的阳离子外排转运蛋白包含一个或多个突变。


8.根据任一前述权利要求的方法，所述方法包括将编码阳离子外排蛋白的多核苷酸内的突变引入所述植物或植物细胞的基因组内，使得所述多核苷酸编码去调控的阳离子外排蛋白。


9.根据权利要求7或权利要求8的方法，其中所述突变在编码所述蛋白质的多核苷酸中产生缺失、剪接突变体或编码非耐受性氨基酸取代的密码子。


10.根据任一前述权利要求的方法，其中当与如SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30所示的氨基酸序列，或者与其具有至少70%同一性的序列相比较时，所述去调控的阳离子外排蛋白包含缺乏N末端的至少一部分的氨基酸序列。


11.根据任一前述权利要求的方法，所述方法包括将外源多核苷酸序列引入所述植物或植物细胞的基因组内，所述外源多核苷酸序列编码去调控的阳离子外排蛋白。


12.根据任一前述权利要求的方法，其中所述去调控的阳离子外排蛋白是：
a）截短的阳离子外排蛋白，其至少缺乏对应于来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的N末端侧的2-25、或2-50、或2-75、或2-100、2-114、2-117、2-120、2-125、2-128、或2-130的氨基酸，或者与截短的蛋白质具有至少70%（优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%）序列同一性的蛋白质，所述截短的蛋白质至少缺乏对应于SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的氨基酸2-25、或2-50、或2-75、或2-100、2-114或2-117的氨基酸；
b）截短的阳离子外排蛋白，其基本上由以下组成或由以下组成：来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的C末端的至少375、至少350、或至少300、或至少250、或至少200、或至少150个氨基酸，或者与截短的蛋白质具有至少70%（优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%）序列同一性的蛋白质，所述截短的蛋白质基本上由以下组成或由以下组成：来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的C末端的至少375、至少350、或至少300、或至少250、或至少200、或至少150个氨基酸。


13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述TSNA是N’-亚硝基降烟碱（NNN）和/或所述前体是降烟碱。


14.一种产生具有减少含量的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体的烟草的方法，其包括：
a.使供体烟草植物与受体烟草植物杂交，所述供体烟草植物产生减少含量的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体，并且包含去调控的阳离子外排蛋白，所述受体烟草植物不产生减少含量的烟草特有亚硝胺（TSNA）或TSNA前体，并且具有商业上期望的性状；
b.从与所述受体植物杂交的所述供体植物的后代中分离遗传材料；和
c.用分子标记物执行分子标记物辅助的选择，其包括：
i.鉴定包含编码a中定义的蛋白质的多核苷酸序列中的突变的基因渗入区域。


15.根据任一前述权利要求的方法，其中所述去调控的阳离子外排蛋白包含如SEQIDNo.33所示的氨基酸序列，或者与其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的序列。


16.根据任一前述权利要求的方法，其中所述去调控的阳离子外排蛋白由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含如SEQIDNo.34所示的序列，或者与其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的序列。


17.一种分离的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：
a.包含SEQIDNo.34的核苷酸序列；
b.与SEQIDNo.34中所示的序列的整体具有至少70%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码涉及植物中的阳离子外排的多肽；
c.核苷酸序列，其编码包含在本文中如SEQIDNo.33所示的氨基酸序列的多肽，或者其包含SEQIDNo.33的至少200、或至少250、或至少300、或至少350、或至少400个连续残基的片段；
d.编码截短的多肽或蛋白质的核苷酸序列，所述截短的多肽至少缺乏对应于来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的N末端侧的2-25、或2-50、或2-75、或2-100、或2-114、或2-117、或2-120、或2-125、或2-128、或2-130的氨基酸，所述蛋白质与截短的蛋白质具有至少70%（优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%）的序列同一性，所述截短的蛋白质至少缺乏对应于SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的氨基酸2-25、或2-50、或2-75、或2-100、或2-114、或2-117、或2-117、或2-120、或2-125、或2-128、或2-130的氨基酸；
e.编码截短的多肽或蛋白质的核苷酸序列，所述截短的多肽基本上由以下组成或由以下组成：来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的C末端的至少375、至少350、或至少300、或至少250、或至少200、或至少150个氨基酸，所述蛋白质与截短的蛋白质具有至少70%（优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%）的序列同一性，所述截短的蛋白质基本上由以下组成或由以下组成：来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的C末端的至少375、至少350、或至少300、或至少250、或至少200、或至少150个氨基酸；
f.编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含对应于SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的氨基酸125-324的氨基酸序列，和/或包含对应于SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的氨基酸323-413的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列编码涉及植物中的阳离子外排的多肽；
g.根据前述项目（a）至（f）中任一项的核苷酸序列，其进一步包含在所述核苷酸序列中的突变，例如其中所述突变在编码所述蛋白质的多核苷酸中产生缺失、剪接突变体或编码非耐受性氨基酸取代的密码子；或
h.与根据前述项目（a）至（g）中任一项的序列互补的核苷酸序列。


18.一种分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
a.包含SEQIDNo.33的氨基酸序列；
b.与SEQIDNo.33中所示的氨基酸序列至少70%等同的氨基酸序列；
c.氨基酸序列，其包含对应于SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的氨基酸125-324的氨基酸，和/或包含对应于SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的氨基酸323-413的氨基酸，其中所述多肽涉及植物中的阳离子外排；
d.其为SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的片段的氨基酸序列，所述片段包含SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的至少200、或至少250、或至少300、或至少350、或至少400个连续残基；
e.其为截短的氨基酸序列的氨基酸或蛋白质，所述截短的氨基酸序列至少缺乏对应于来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的N末端侧的2-25、或2-50、或2-75、或2-100、或2-114、或2-117、或2-117、或2-120、或2-125、或2-128、或2-130的氨基酸，所述蛋白质与截短的蛋白质具有至少70%（优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%）的序列同一性，所述截短的蛋白质至少缺乏对应于SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的氨基酸2-25、或2-50、或2-75、或2-100、或2-114、或2-117、或2-117、或2-120、或2-125、或2-128、或2-130的氨基酸；
f.其为截短的氨基酸序列的氨基酸或蛋白质，所述截短的氨基酸序列基本上由以下组成或由以下组成：来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的C末端的至少375、至少350、或至少300、或至少250、或至少200、或至少150个氨基酸，所述蛋白质与截短的蛋白质具有至少70%（优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%）的序列同一性，所述截短的蛋白质基本上由以下组成或由以下组成：来自SEQIDNo.3、6、9、12、15、18、21、24、27或30的C末端的至少375、至少350、或至少300、或至少250、或至少200、或至少150个氨基酸；
或
g.与SEQIDNo.33中所示的序列的整体具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。


19.一种构建体或载体，其包含根据权利要求17的多核苷酸或编码根据权利要求18的多肽的多核苷酸。


20.一种烟草植物或其部分，其：
a.与未修饰的植物相比，已进行修饰以实现TSNA或TSNA前体的减少，其中所述修饰的植物或其部分包含去调控的阳离子外排蛋白；
b.在编码阳离子外排蛋白的植物基因内具有突变，所述突变使所述阳离子外排蛋白去调控，其中在突变之前的基因包含如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·本卡莱德，F·阿纳斯塔乔德阿布鲁埃利马，
申请(专利权)人：英美烟草投资有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB