一种ssODN介导的牡蛎基因组定点突变或插入的方法技术

本发明专利技术公开了一种ssODN介导的牡蛎基因组定点突变或插入的方法，包括：合成外源供体模板‑单链寡核苷酸；体外转录合成CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9 mRNA和靶基因sgRNA；然后将ssODN、Cas9 mRNA、靶基因sgRNA和非同源修复抑制剂KU5778进行混合得到混合物，利用显微注射方法将该混合物导入至牡蛎受精卵中。本发明专利技术利用ssODN介导结合CRISPR/Cas9基因编辑技术，以牡蛎为研究对象针对性地设计ssODN序列，并确定该序列的长度，最终通过显微注射成功实现了牡蛎的基因组定点突变或插入。本发明专利技术为以后开展牡蛎基因功能研究和遗传改良提供了强有力的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种ssODN介导的牡蛎基因组定点突变或插入的方法
本专利技术属于海洋生物基因编辑
，具体地涉及一种ssODN介导的牡蛎基因组定点突变和插入的方法。
技术介绍
CRISPR/Cas9基因编辑技术因具有操作简单、靶点选择广、成本低、效率高等优点，自诞生以来便受到了广大科研人员的关注并得到迅速发展。目前已成为生命科学、医学等研究领域中最受瞩目、最具前景的技术之一。2020年诺贝尔化学奖授予CRISPR/Cas9基因编辑技术，再一次证实了该技术的巨大影响力。在基础研究层面，CRISPR/Cas9技术极大促进了模式物种尤其是非模式物种的基因功能研究。目前，研究者利用CRISPR/Cas9技术已成功的在猪、羊、猴、高粱、牡蛎、脊尾白虾等多种动植物中实现基因编辑。CRISPR/Cas9系统由sgRNA和Cas9蛋白(或Cas9mRNA)组成，sgRNA通过碱基互补配对识别特异性基因组序列，引导Cas9蛋白结合靶点处产生基因组双链断裂，伴随着双链断裂的是细胞DNA损伤修复。一般情况下，真核细胞DNA修复有两种方式，同源重组修复(HDR)和非同源本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ssODN介导的牡蛎基因组定点突变或插入的方法，其特征在于，该方法包括：合成外源供体模板-单链寡核苷酸ssODN；体外转录合成CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9mRNA和靶基因sgRNA；然后将所述ssODN、Cas9 mRNA、靶基因sgRNA和非同源修复抑制剂KU5778进行混合得到混合物，利用显微注射方法将该混合物导入至牡蛎受精卵中。/n

【技术特征摘要】
1.一种ssODN介导的牡蛎基因组定点突变或插入的方法，其特征在于，该方法包括：合成外源供体模板-单链寡核苷酸ssODN；体外转录合成CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9mRNA和靶基因sgRNA；然后将所述ssODN、Cas9mRNA、靶基因sgRNA和非同源修复抑制剂KU5778进行混合得到混合物，利用显微注射方法将该混合物导入至牡蛎受精卵中。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链寡核苷酸ssODN的长度≥120bp。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ssODN的序列，以基因组中sgRNA靶点序列及其左右侧翼序列进行设计，sgRNA靶点序列位于中间位置，左右侧翼序列≥40bp。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ssODN序列中，在sgRNA靶点序列处进行碱基定点突变设计或者定点插入碱基序列设计。...

【专利技术属性】
技术研发人员：于红，李琪，李绘娟，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37