一种人卵母细胞质量评价的方法技术

本发明专利技术公开了一种人卵母细胞质量评价的方法，通过对卵泡液蛋白质成分的分析，获取差异的蛋白质表达情况，进一步通过酶联免疫实验，研究发现了CD5L可以作为人卵母细胞发育成熟度与发育潜能的评价蛋白质。熟度与发育潜能的评价蛋白质。熟度与发育潜能的评价蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
一种人卵母细胞质量评价的方法


[0001]本专利技术涉及生殖医学
，具体涉及一种人卵母细胞质量评价的方法。

技术介绍

[0002]我国不孕症患者目前已经占到育龄人口的12.5％，人数已经超过4000万，并呈现出快速增长的趋势。辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)为不孕症患者带来了诞生新生命体的希望，然而在体外受精(in vitro fertilization，IVF)中，近80％的胚胎着床失败，为提高成功率，各生殖中心进行多胚胎移植，由此多胎妊娠随之增加，而多胎妊娠出生的新生儿早产、死产、低出生体重、出生缺陷及母亲高血压等并发症均较自然受孕高。因此，准确预测卵母细胞的发育潜能，挑选出优质卵母细胞进行IVF，进而选出单个胚胎进行移植对提高IVF妊娠结局、孕育健康子代具有重大意义。
[0003]获得具有良好发育潜能的卵母细胞是人类现代辅助生殖技术(ART)中相当重要的一环，它直接决定了是否能够获得优质的胚胎以供后续移植。目前形态学方法是评估卵母细胞发育潜能最常用的方法，主要采取卵丘卵母细胞复合体(cumulus
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oocyte complexes，COCs)形态、第一极体形态、卵周隙大小、胞质形态、纺锤体形态学等判断卵母细胞质量。目前，已有相关的研究，例如中国专利申请CN201811414043一种分析卵泡液代谢物与卵母细胞质量之间关系的方法，所述方法包括比较卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成，通过代谢组学分析，筛选特征生物标志物，明确卵泡液代谢标志物组与卵母细胞质量间关系，建立了更加客观的、无创的卵母细胞质量评估方法。又例如中国专利申请CN201811411930一种用于评价卵母细胞质量的组合物及试剂盒，提供了一种包括N
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乙酰
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D
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色氨酸和亚牛磺酸的组合物以及一种卵母细胞质量评价试剂盒，所述组合物用作卵母细胞质量评价系统中的标准品，通过比较卵泡液中N
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乙酰
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D
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色氨酸、亚牛磺酸与所述组合物中相应组分的含量来评价卵母细胞的质量。可以此为依据为IVF
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ET技术挑选优质的卵母细胞，获得较高质量的胚胎进行移植，从而增加妊娠率，降低流产率，对孕育健康子代具有重大意义。
[0004]然而，由于外源性促排卵药物的使用，取卵手术获得的卵母细胞容易发生核成熟和细胞质成熟不同步的状况。这些卵母细胞虽然从形态学上看似已经成熟，但其发育潜能较低，受精后的囊胚发育率和种植率也较低。核质不同步的卵母细胞从形态学上看已经成熟，但实际上质量较差，因此，也就更容易导致受精失败、胚胎发育缺陷、流产等的不良结局。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中取卵手术获得的卵母细胞容易发生核成熟和细胞质成熟不同步的不足，本专利技术提供了一种人卵母细胞质量评价的方法，通过对卵泡液蛋白质成分的分析，获取差异的蛋白质表达情况，再通过酶联免疫实验，以CD5L作为人卵母细胞发育质量与发育潜能的评价蛋白质。
[0006]一种人卵母细胞质量评价的方法，包括如下步骤：
[0007]1)收集一批进行取卵手术的ART患者的成熟卵母细胞卵泡液和未成熟卵母细胞卵泡液，鉴定成熟卵母细胞卵泡液和未成熟卵母细胞卵泡液中的蛋白质；
[0008]2)通过IPeak和IQuant软件从步骤1)鉴定的蛋白质中挑选出表达上调或表达下调，并且差异具有统计学意义的蛋白质，对鉴定到的所有蛋白质进行功能注释与分类分析；
[0009]3)从步骤2)挑选出的蛋白质中，通过酶联免疫吸附剂测定(ELISA)筛选出前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，ACPP，P15309)和CD5样蛋白(CD5 antigen
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like，CD5L，O43866)在成熟卵(MII)卵泡液、未成熟(Gv)卵泡液中存在差异表达；
[0010]4)另外收集一批进行取卵手术的ART患者的卵母细胞卵泡液，根据卵母细胞质量分为对照组(control，CON)和卵巢反应低下组(poor ovarian response，POR)，比较CD5L在对照组和卵巢反应低下组的卵泡液蛋白质差异表达，如CD5L在卵巢反应低下组显著降低，则将CD5L用于评估人卵母细胞质量。
[0011]本专利技术中：
[0012]步骤1)所述的鉴定卵母细胞卵泡液中的蛋白质，是通过iTRAQ
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2DLC
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MS/MS技术鉴定卵母细胞卵泡液中的蛋白质，即通过同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)结合二维液相色谱
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串联质谱(2DLC
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MS/MS)技术鉴定卵母细胞卵泡液中的蛋白质。
[0013]步骤2)所述的挑选出表达上调或表达下调，并且差异具有统计学意义的蛋白质，是挑选出组间比值≥1.2(表达上调)或≤0.8(表达下调)，并且P<0.05的蛋白质。
[0014]步骤2)所述的对鉴定到的所有蛋白质进行功能注释与分类分析，是对鉴定到的所有蛋白质进行GO、KEGG、KOG和COG等数据库的功能注释与分类分析，以比值≥1.2(表达上调)或≤0.8(表达下调)，并且P<0.05为限，再次对差异表达蛋白进行GO、KEGG、聚类分析和蛋白
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蛋白相互作用分析。
[0015]步骤4)所述的比较CD5L在对照组和卵巢反应低下组的卵泡液蛋白质差异表达，是为了明确CD5L差异蛋白质是否与卵母细胞的发育潜能相关。
[0016]和现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0017]1、卵母细胞位于卵泡腔内，腔内充满卵泡液。卵泡液中的许多成分(蛋白质、细胞生长因子、肽类激素、类固醇、能量代谢产物等)，都随着卵母细胞的生长发育发生动态变化，对卵母细胞的成熟起到正向或负向调控的作用。本专利技术所述的一种人卵母细胞质量评价的方法，通过对卵泡液蛋白质成分的分析，获取差异的蛋白质表达情况，进一步通过酶联免疫实验，研究发现了CD5L可以作为人卵母细胞发育成熟度与发育潜能的评价蛋白质。
[0018]2、现应用的卵母细胞评估标准仅从形态学(极体是否排出，胞浆内是否有生殖泡)来判断卵母细胞是否成熟。但是因为外源性雌激素促排药物的应用，很多临床获取的卵母细胞虽然从形态学上看似已经成熟，但实质上胞浆与核成熟不同步，质量较差。本专利技术所述的一种人卵母细胞质量评价的方法从分子层面出发，应用蛋白组学及分子生物学技术，获得了CD5L作为人卵母细胞发育成熟度的评价蛋白质，较原有的形态学观察更为客观，准确度和灵敏度更高，也更符合卵母细胞的成熟机理。
[0019]3、卵母细胞质量与女性年龄、抗苗勒管激素、窦卵泡个数等卵巢储备关键因子相关联。本专利技术所述的一种人卵母细胞质量评价的方法引入卵巢反应低下人群，进一步确认CD5L不仅可以作为卵母细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人卵母细胞质量评价的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)收集一批进行取卵手术的ART患者的成熟卵母细胞卵泡液和未成熟卵母细胞卵泡液，鉴定成熟卵母细胞卵泡液和未成熟卵母细胞卵泡液中的蛋白质；2)通过IPeak和IQuant软件从步骤1)鉴定的蛋白质中挑选出表达上调或表达下调，并且差异具有统计学意义的蛋白质，对鉴定到的所有蛋白质进行功能注释与分类分析；3)从步骤2)挑选出的蛋白质中，通过酶联免疫吸附剂测定筛选出前列腺酸性磷酸酶和CD5样蛋白在成熟卵卵泡液、未成熟卵泡液中存在差异表达；4)另外收集一批进行取卵手术的ART患者的卵母细胞卵泡液，根据卵母细胞质量分为对照组和卵巢反应低下组，比较CD5样蛋白在对照组和卵巢反应低下组的卵泡液蛋白质差异表达，如CD5样蛋白在卵巢反应低下组显著降低，则将CD5样蛋白用于评估人卵母细胞质量。2.根据权利要求1所述的一种人卵母细胞质量评价的方法，其特征在于：步骤1)所述的鉴定卵母细胞卵泡液中的蛋白质，是通过iTRAQ
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【专利技术属性】
技术研发人员：王冲，冯颖，张红艳，江美燕，周燕，
申请(专利权)人：杭州市妇产科医院，
类型：发明
国别省市：