一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统技术方案

本发明专利技术提供一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片，通过控制体积调节电极实现液滴体积调节，可完成多个独立聚合酶链式反应，可搭配不同试剂实现不同的检测指标，扩增方法可采用基于可变温温度模块或温度恒定温度模块两种形式。在单个芯片上包含磁珠法核酸提取和聚合酶链式反应的功能，用户仅需要向芯片加载样品即可实现全流程全自动聚合酶链式反应多联检测，并可配合荧光检测模块实现定性或定量检测(即qPCR)，还可通过电极设计或级联实现更高检测通量。更高检测通量。更高检测通量。

【技术实现步骤摘要】
一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统


[0001]本专利技术属于数字微流控
，涉及一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(PCR)为核酸检测最常用的实验方法，其基本流程为：检测样本与反应试剂结合后首先进行逆转录反应和预变性反应，然后变形反应和退火、延伸反应温度之间进行30
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50次温度循环实现目标核酸片段复制。传统的PCR的检测手段使用在所有温度循环完成后以核酸电泳的方式检测目标核酸片段扩增结果，目前较为常用的检测手段是在PCR检测试剂中加入荧光探针，利用荧光检测装置在所有温度循环后或在每一个温度循环完成后检测反应溶液的荧光信号强度，以此检测目标核酸片段的扩增结果。目前商业化的PCR检测设备主要配合例如96孔板、384孔板进行使用，检测样本和试剂混合好后加入孔板的反应井中，利用高精度变温模块实现温度循环，配合荧光检测装置实现结果判定。聚合酶链式反应多联检测是一项重要的检测手段，尤其在例如呼吸道病毒、细菌检测方面有非常重要的应用价值，目前实现聚合酶链式反应多联检测的主要手段依然是依赖手动操作，Biofire的Filmarray产品和Genmark的ePlex产品分别利用微流控技术实现了全流程全自动聚合酶链式反应多联检测，极大的提高了检测效率。
[0003]传统的手动操作的主要缺陷在于检测效率低下，检测耗时长，需要配备专业的检测实验室和专业技术人员才能够完成，且检测过程中操作人员的误操作可能导致实验失败或样本污染等风险造成检测结果不可靠。Biofire的Filmarray产品采用压力式微流控芯片实现了全流程全自动聚合酶链式反应多联检测，但是由于该芯片制造工艺复杂导致成本高昂，难以达到市场对该检测方法的价格预期。Genmark的ePlex产品的检测手段采用的是电化学基因杂交而非被行业普遍认可的聚合酶链式反应，其检测结果可靠性方面不如聚合酶链式反应，且同样存在芯片制造成本高昂的缺陷。
[0004]因此，有必要提供一种新的集成度高、成本低、可靠性强的全自动数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统，在基于聚合酶链式反应的核酸检测
具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统。在单个芯片上包含一个样本的磁珠法核酸提取功能，可容纳多个独立PCR或qPCR反应和1组阴阳对照反应，用户仅需要向芯片加载样品即可实现全流程全自动聚合酶链式反应多联检测。
[0006]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片，其主要包含多个样本/试剂入口1、多个储液区2、废液区3、搅拌区4、磁珠分离点5、x个混合分配区
6、y排扩增区7和体积调节电极8；所述x和y为大于等于1的正整数；
[0008]优选地，所述芯片装载于检测设备之上并使所述芯片内充满生物兼容性介质油；
[0009]优选地，所述芯片通过体积调节电极8实现液滴体积调节；
[0010]优选地，所述芯片上包含一组阴性对照和/或一组阳性对照作为内参；
[0011]优选地，样本及试剂加载位置如图2所示；
[0012]优选地，所述试剂可以采用移液枪注射的方式、独立试剂包加载的方式或试剂在芯片中预埋的方式实现加载；
[0013]优选地，所述芯片可搭配不同试剂实现不同的检测指标；
[0014]优选地，所述芯片功能包含磁珠法核酸提取和聚合酶链式反应；
[0015]优选地，所述芯片扩增区的下方还配置有温度模块，用于实现温度控制从而满足聚合酶链式反应所需温度循环条件；
[0016]在一个实施方案中，所述温度模块为变温温度模块9，所述变温温度模块9可使扩增区的温控方式采用如图5所示的变温温控方式，在此温控方式下，n个独立聚合酶链式反应溶液不需要移动，通过改变变温温度模块9的温度实现聚合酶链式反应所需温度循环条件，实现扩增；
[0017]在另一个实施方案中，所述温度模块为恒定温度模块10和11，各个独立聚合酶链式反应溶液需要在两个温度区间间往复移动，从而实现聚合酶链式反应所需温度循环条件；
[0018]优选地，所述温度模块10保持例如恒定变性温度不变，用于进行变性反应；
[0019]优选地，所述温度模块11在逆转录反应阶段保持例如恒定逆转录温度不变，用于进行逆转录反应，在逆转录反应完成后升至例如恒定退火、延伸温度不变，用于进行退火、延伸反应；
[0020]优选地，所述变性温度为92
‑
99℃，优选为95℃；
[0021]优选地，所述逆转录温度为45
‑
75℃，优选为50℃；
[0022]优选地，所述退火、延伸温度为55
‑
75℃，优选为60℃。
[0023]第二方面，本专利技术提供了一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统，所述系统包括第一方面所述的数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片。
[0024]优选地，所述数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统包括荧光检测模块，可实现定性或定量检测(即qPCR)；
[0025]优选地，所述数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统包括电极设计或级联，以实现更高检测通量。
[0026]第三方面，本专利技术提供了一种利用第一方面所述的芯片或第二方面所述的系统进行聚合酶链式反应多联检测的方法，所述方法包括：
[0027](1)手动配置样本、裂解液、磁珠的混合溶液并震荡使之混合均匀，该步骤采取手动的原因是为了保证样本中细胞的充分裂解和与磁珠的充分混合；
[0028](2)将芯片装载于检测设备之上并使芯片内充满生物兼容性介质油，按照图2在对应入口按规定体积加载第一步的混合液以及各种试剂；
[0029](3)含有Master Mix 2X的混合分配区6充分混合并分配出n滴等体积的Master Mix 2X液滴并转移至n个靠近引物入口的位置；
[0030](4)含有去离子水的混合分配区6充分混合，并在关闭体积调节电极8的条件下分配出2滴等体积的去离子水液滴，并转移至靠近引物阴性对照、阳性对照入口的位置；
[0031](5)样本、裂解液、磁珠的混合溶液在搅拌区4充分搅拌并在磁珠分离点5进行磁珠分离，洗涤液、漂洗液依次与磁珠在搅拌区4充分搅拌并在磁珠分离点5进行磁珠分离，洗脱液与磁珠在搅拌区4充分搅拌并在磁珠分离点5进行磁珠分离，将洗脱液转移至含有去离子水的混合分配区6；
[0032](6)含有去离子水和洗脱液的混合分配区6充分混合，并在开启体积调节电极8的条件下分配出m滴等体积的液滴，并转移至除引物阴性对照、阳性对照的靠近引物入口的位置，需要指出步骤(4)中去离子水的液滴与阴性或阳性对照的体积之和等于该步骤所分配的液滴体积；
[0033](7)将扩增区的n个独立聚合酶链式反应溶液充分混合；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2X液滴并转移至n个靠近引物入口的位置；(4)含有去离子水的混合分配区(6)充分混合并在关闭体积调节电极(8)的条件下分配出2滴等体积的去离子水液滴并转移至靠近引物阴性对照、阳性对照入口的位置；(5)样本、裂解液、磁珠的混合溶液在搅拌区(4)充分搅拌并在磁珠分离点(5)进行磁珠分离，洗涤液、漂洗液依次与磁珠在搅拌区(4)充分搅拌并在磁珠分离点(5)进行磁珠分离，洗脱液与磁珠在搅拌区(4)充分搅拌并在磁珠分离点(5)进行磁珠分离，将洗脱液转移至含有去离子水的混合分配区(6)；(6)含有去离子水和洗脱液的混合分配区(6)充分混合，并在开启体积调节电极(8)的条件下分配出m滴等体积的液滴，并转移至除引物阴性对照、阳性对照的靠近引物入口的位置，需要指出步骤(4)中去离子水的液滴与阴性或阳性对照的体积之和等于该步骤所分配的液滴体积；(7)将扩增区的n个独立聚合酶链式反应溶液充分混合；(8)在扩增区对n个独立聚合酶链式反应进行扩增，配合荧光检测装置实现荧光信号检测和结果判定。8.根据权利要求7所述的聚合酶链式反应多联检测方法，其特征在于，所述n和m为大于等于1的正整数；优选地，扩增区的温控方式采用基于变温温度模块(9)的温控方式，n个独立聚合酶链式反应溶液不需要移动，通过改变变温温度模块(9)的温...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏阳，张研，
申请(专利权)人：苏阳，
类型：发明
国别省市：