利用成像细胞计数术的病毒中和测定法制造技术

本发明专利技术描述了病毒减少中和测试(VRNT)，其为当前标准的低通量和费力的中和测定法的快速、高通量替代方案。VRNT利用成像细胞计数法在感染后约一天对病毒

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用成像细胞计数术的病毒中和测定法
[0001]专利技术背景登革热(DEN)是一种黄病毒科(黄病毒属)的蚊子传播的正义RNA病毒，其具有四种不同的血清型(DEN 1
‑
4)。登革热影响超过40%的世界人口，并且是世界的亚热带和热带地区中幼儿中的疾病和死亡的主要原因(WHO. Dengue Fact Sheet (2007))。随后登革热病毒毒株的感染是严重疾病的危险因素，并且与90%的登革出血热(DHF)病例有关，而原发感染后呈现DHF的剩余10%主要是生命的第一年内的儿童(Green, S.和Rothman A., Curr. Opin. Infect. Dis. (2006) 19:429
‑
36)。高流行区域传播所有四种血清型。因此，登革热的疫苗应当是四价的，提供均衡的免疫应答(WHO. Geneva, 2013)，并保护幼儿。一种疫苗(Dengvaxia
®ꢀ
(CYD
‑
TDV))目前在几个流行国家中被许可用于9
‑
45岁的个体，其中年龄依赖性疫苗效力为45
‑
66% (Hadinegoro, S.R. 等人, N. Engl. J. Med. (2015) 373:1195
‑
1206; Godoi, I. P. 等人, J. Comp. Eff. Res. (2017) 6:165
‑
180)。该疫苗由于在幼稚(na
ï
ve)受试者中缺乏效力而在幼儿(<9岁)中禁忌使用，并且得到III期试验中接种疫苗的2
‑
5岁儿童中住院增加的支持。世界卫生组织(WHO)设定了到2020年全世界登革热疾病减少25%和死亡减少50%的目标(WHO Press, Geneva, 2012)；因此，迫切需要一种改进的登革热疫苗，尤其是在较年幼儿童中有效的登革热疫苗。
[0002]疫苗引发免疫应答的能力对于疫苗开发至关重要，并且在确定临床效力中是重要的。血清抗体应答的量度是评价免疫原性的优选方法。具体地，功能性中和抗体测试是经常进行以检测可有效中和病毒、预防体外感染的抗体量的血清学测定法。一种测量登革热病毒中和的技术是使用用悬浮细胞的流式细胞计数术，并且需要在固定和染色过程中的额外步骤(de Silva等人, J. Clin. Microbiology, (2007) 45:3777
‑
3780)。当前用于测量病毒中和(包括登革热病毒中和)的金标准测试是噬斑减少中和测试(PRNT)，或类似的病灶减少中和测试(FRNT)，其利用免疫染色来将感染后的“噬斑”(称为病灶)可视化(当病毒感染和进一步复制从细胞扩散至细胞时生成噬斑)。由于病毒感染速率慢，这些测试是非常耗时的。例如，一些病毒可能花费数天(最多达5天或更多天)来经由噬斑或病灶形成显示可检测的感染。24
‑
孔板形式已用于登革热临床样品FRNT测试(Durbin, A. P. 等人, Am. J. Trop. Med. Hyg. (2001) 65:405
‑
413; Timiryasova, T. M. 等人, Am. J. Trop. Med. Hyg. (2013) 88:962
‑
970)，对于2倍稀释方案，其每板仅容纳一个一式两份样品。当前开发中的登革热疫苗是四价的(Torresi, J. 等人, Hum. Vaccin. Immunother. (2017) 13:1059
‑
1072)，由此使每个样品的测试数增加4倍。对于包括数千个参与者的大型研究，所需的板的数量变得累赘，并且测试加上分析的时间冗长，因此，涵盖接种疫苗的受试者的亚组的随机免疫原性组经常代替完整的样品测试(Saez
‑
Llorens, X. 等人, Lancet Infect. Dis. (2017) 17:615
‑
625; L
’
Azou, M. 等人, N. Engl. J. Med. (2016) 374:1155
‑
1166)。因此，迫切需要改进当前的测试方法以减少测定时间并增加通量。本文描述了病毒减少中和测试(VRNT)。
[0003]专利技术概述本专利技术描述了病毒减少中和测试(VRNT)，其为当前标准的低通量和费力的中和测
定法的快速、高通量替代方案。VRNT利用成像细胞计数法在感染后约一天对病毒
‑
感染的细胞进行计数(因此消除了其他测定法采用的允许病毒感染从细胞至细胞的等待时间)，减少总体测定时间，并将通量增加至少15倍。
[0004]附图简述图1. VRNT和FRNT方法的并排比较。在该图中，第1天被视为板接种，而不是测定第1天。差异包括板形式(对于VRNT为96
‑
孔，且对于FRNT为24
‑
孔)，感染时间以及二抗和检测。VRNT检测依赖于荧光染色的细胞和细胞计数仪计数；FRNT依赖于过氧化物酶底物和病灶形成来进行手工病灶计数。
[0005]图2. MOI和一抗浓度对S/N比的相互作用图。
[0006]图3. 用DEN1
‑
4使用单个阳性供体血清样品经四天的FRNT。经四天的病灶发展揭示较小的病灶可能密切接近。比例尺代表2 mm。(A)经四天的FRNT
50
滴度揭示经四天产生的广泛范围的滴度(B)。
[0007]图4. VRNT/FRNT一致性。DEN1
‑
4的VRNT
50
和FRNT
50
一致性图(A)。VRNT
50
和FRNT
50
测定程序之间的一致性量度(B)。
[0008]图5. 在37℃下孵育过夜之前，在室温(RT)下在孵育和不孵育的情况下接种的板的DRAQ5染色计数和热图。
[0009]图6. 未在室温下放置或在室温下放置、然后在37℃下放置过夜的板的DRAQ5对象计数(A)，以及对于选择的30分钟时间点和门控(15/45分钟)时间的对应的VRNT
50
滴度(B)和%CV (C)。
[0010]专利技术详述本专利技术涉及病毒中和测定法，其包括：感染步骤，其中感染时间持续不长于约24小时；和成像步骤，其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。
[0011]在另一个实施方案中，本专利技术涉及测定样品中的中和抗体滴度的病毒中和测定法，其包括：感染步骤，其中感染时间持续不长于约24小时；和成像步骤，其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。
[0012]在另一个实施方案中，本专利技术涉及测定样品中的中和抗体滴度的病毒中和测定法，其包括：A)孵育步骤；B)铺板步骤；C)感染步骤，其中感染时间持续不长于约24小时；D)固定步骤；E)检测步骤；和F)成像步骤：其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。
[0013]在另一个实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.测定样品中的中和抗体滴度的病毒中和测定法，其包括：感染步骤：其中感染时间持续不长于约24小时；和成像步骤：其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。2.权利要求1的病毒中和测定法，其包括：A)孵育步骤；B)铺板步骤；C)感染步骤：其中感染时间持续不长于约24小时；D)固定步骤；E)检测步骤；和F)成像步骤：其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。3.权利要求1的病毒中和测定法，其包括：A)孵育步骤：其中孵育包含病毒和样品抗体的混合物，其中一定量的所述样品抗体结合一定量的病毒，使结合的病...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：