一种生物酶法合成乳清酸的方法技术

本发明专利技术公开一种生物酶法合成乳清酸的方法，以氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸合成酶、二氢乳清酸脱氢酶组成体外多酶催化体系，催化底物转化为乳清酸，所述底物包括谷氨酰胺和/或氨、CO

【技术实现步骤摘要】
一种生物酶法合成乳清酸的方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种多酶反应催化合成乳清酸的方法及应用，属于乳清酸的酶催化制备领域。
技术介绍
乳清酸，即6-羧基尿嘧啶，酮式名称是1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-4-嘧啶羧酸，烯醇式名称是2,6-二羟基嘧啶-4-羧酸，也称维生素B13。乳清酸主要存在于根茎类蔬菜、乳浆、酸奶或炼乳的液态部分，作为生物活体嘧啶核酸生物合成过程中的重要中间体，在生物和药物化学中发挥独特的作用(RoutDK,etal.Macromolecules,2002,27(11):2945-2950)。乳清酸及其衍生物在医药领域用途广泛。在60年代，乳清酸用于治疗黄胆和一般肝脏机能障碍(王玉明等营养学报，2009.31(4))，近年来虽然渐渐被新药代替，但在改善肝功能、促进肝细胞的修复以及其它方面仍然发挥作用。乳清酸基团参与的药物分子可治疗痛风病、心肌梗塞、胃溃疡、增结核杆菌。另外，乳清酸还可用于免疫辅药，作为化学品中毒的预防剂和治疗剂。在食品和饲料行业，乳清酸主要用作食品和饲料添加剂。在化妆品工业主要用作增白剂中间体。乳清酸是合成嘧啶碱基(尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶)和嘧啶碱基结构类似物(例如5-氟尿嘧啶)的原料，而这些化合物是合成一些抗肿瘤、抗病毒药物的中间体(Dong,etal.ChemJChinUni,1996,17(6):973-977)。已经开发出以乳清酸为原料生产的核酸类保健食品与药物，能影响和控制许多生命代谢活动，对延缓人体衰老具有明显效果。由于乳清酸用途广泛，因而对其合成研究越来越得到重视。目前，具有工业化前景的乳清酸合成技术主要分为化学合成法和发酵法。化学合成法近年已报到多种路线：一是从氨甲酰天冬氨酸出发，合成乙内酰脲基代醋酸，接着合成羧基甲基乙内酰脲，最终合成乳清酸(吴信等.一种乳清酸的制备方法.2015)。该方法需要高压，反应条件苛刻，收率只有56％；二是将甘脲和乙二醛在碱性溶液中先缩合，再通氯气氧化，一锅法制得乳清酸粗品，粗品经脱色精制得到乳清酸，收率达30％(石常青.一种乳清酸的合成方法.2016)；三是将马来酰脲与溴反应，再向反应体系中倒入碱性溶液，形成含乳清酸盐的混合物，再调pH至酸性，分离纯化出乳清酸，收率达48％(陈晓龙等.一种制备乳清酸的方法.2017)。日本从60年代已开始研究发酵法(KiyoshiNakayama,ZenrokuSato.NipponNogeiKagakuKaishi,1965,39(3))，张等使用谷氨酸棒杆菌JSIM-201的尿嘧啶营养缺陷突变菌株U-12，在最佳发酵工艺条件下，积累乳清酸最高达到8.6g/L(张一平等.无锡轻工大学学报.2003.22(3))。此外还有报道使用白色念珠菌ura3突变体，以乙酸盐为前体最高可产3g/L乳清酸(TakashiNezu,OsamuShimokawa.MicrobiolImmunol,2004,48(10))。但是发酵法产品收率较低。而现有的化学合成方法制得的产品中容易包含杂质，不易制备高纯度的乳清酸产品，且工业化生产中操作繁琐，通常还会产生大量环境有害的物质，不利于环境保护，也不利于生产人员的身心健康。因此，亟需研发一种高收率、高纯度且操作简便、环境友好的乳清酸制备方法。虽然乳清酸合成的研究主要集中在化学合成上，但在生物体内，乳清酸可通过酶反应获得。目前尚无体外酶法合成乳清酸的报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种高收率、高纯度且操作简便、环境友好的生物酶法合成乳清酸的方法。为实现以上目的，本专利技术公开以下技术方案：一种生物酶法合成乳清酸的方法，其特征在于，以氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸合成酶、二氢乳清酸脱氢酶组成多酶催化体系，催化底物转化为乳清酸，所述底物包括谷氨酰胺和/或氨、CO2和/或碳酸氢盐、天冬氨酸、ATP和/或ADP，和其它少量无机盐。作为一个优选方案，催化反应为，氨甲酰磷酸合成酶催化CO2和/或碳酸氢盐，谷氨酰胺和/或氨，ATP和/或ADP形成氨甲酰磷酸；天冬氨酸转氨甲酰酶催化氨甲酰磷酸和天冬氨酸生成氨甲酰天冬氨酸；二氢乳清酸合成酶与天冬氨酸转氨甲酰酶催化氨甲酰天冬氨酸为二氢乳清酸；随后二氢乳清酸脱氢酶催化二氢乳清酸生产乳清酸。作为一个优选方案，所述氨甲酰磷酸合成酶的含量为5-15U/mL，所述天冬氨酸转氨甲酰酶的含量为1-3U/mL，二氢乳清酸合成酶的含量为0.4-1U/mL，二氢乳清酸脱氢酶的含量为0.7-3U/mL。氨甲酰磷酸合成酶的含量为：每分钟生成1μmolADP所需的酶量；天冬氨酸转氨甲酰酶的含量为：每分钟生成1μmol氨甲酰天冬氨酸所需的酶量；二氢乳清酸合成酶的含量为：每分钟消耗1μmol氨甲酰天冬氨酸所需的酶量；二氢乳清酸脱氢酶的含量为：每分钟生成1μmol二氢乳清酸所需的酶量。作为一个优选方案，催化反应温度为30-45℃，pH为8.0-6.0，反应时间2-5h。氨甲酰磷酸合成酶(carbamylphosphatesynthetase；carbamoylphosphatesynthetase，EC6.3.5.5，简称为CPS)参与生物体内嘧啶核苷酸的合成，催化谷氨酰胺、ATP和碳酸根合成氨甲酰磷酸的酶。天冬氨酸转氨甲酰酶(Aspartatecarbamoyltransferase，EC2.1.3.2，简称为ATCase)是嘧啶核苷酸从头合成中很重要的一个酶，它催化的是天冬氨酸与氨甲酰磷酸生成氨甲酰天冬氨酸和磷酸的反应。二氢乳清酸合成酶(Dihydroorotase，EC3.5.2.3，简称为DHOase)在嘧啶核苷酸合成过程中催化氨甲酰天冬氨酸和二氢乳清酸可逆的脱水反应。二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotatedehydrogenase，EC1.3.98.1，简称为DHOD)，在嘧啶生物合成过程中，催化二氢乳清酸脱氢生成乳清酸的酶。作为一个优选方案，所述氨甲酰磷酸合成酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述天冬氨酸转氨甲酰酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述二氢乳清酸合成酶的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述二氢乳清酸脱氢酶序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的一个实施例中，所需的氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸合成酶、二氢乳清酸脱氢酶的制备方法如下：(1)将SEQIDNO.1～4所示的核苷酸序列分别连接质粒中，得到重组质粒，然后转化至Rosetta(DE3)，得到重组菌。(2)培养重组菌，诱导表达重组蛋白，在利用压力破碎仪破碎收集的菌体，离心收集上清中的粗酶液，通过镍亲和层析柱纯化4种蛋白。本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌以pET-28a(+)为表达载体。本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌以Rosetta为宿主菌。本专利技术的一种实施方式中，所述体外催化反应以CO2和氨水作为C、N供体，催化乳清酸的合成。本专利技术的优点在于：(1)本专利技术构建的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物酶法合成乳清酸的方法，其特征在于，以氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸合成酶、二氢乳清酸脱氢酶组成体外多酶催化体系，催化底物转化为乳清酸，所述底物包括谷氨酰胺和/或氨、CO

【技术特征摘要】
1.一种生物酶法合成乳清酸的方法，其特征在于，以氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸合成酶、二氢乳清酸脱氢酶组成体外多酶催化体系，催化底物转化为乳清酸，所述底物包括谷氨酰胺和/或氨、CO2和/或碳酸氢盐、天冬氨酸、ATP和/或ADP，和其它少量无机盐。


2.根据权利要求1所述一种生物酶法合成乳清酸的方法，其特征在于，催化反应为，氨甲酰磷酸合成酶催化CO2和/或碳酸氢盐，谷氨酰胺和/或氨，ATP和/或ADP形成氨甲酰磷酸；天冬氨酸转氨甲酰酶催化氨甲酰磷酸和天冬氨酸生成氨甲酰天冬氨酸；二氢乳清酸合成酶与天冬氨酸转氨甲酰酶催化氨甲酰天冬氨酸为二氢乳清酸；随后二氢乳清酸脱氢酶催化二氢乳清酸生产乳清酸。


3.根据权利要求2所述一种生...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志敏，李宗霖，沈苏，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31