【技术实现步骤摘要】
在生物体内创制新基因的方法及应用
本专利技术涉及基因工程和生物信息学
，具体而言，涉及一种在无人工DNA模板的前提下，在生物体内创制新基因的方法及应用。
技术介绍
一般来讲，生物体内一个完整的基因表达盒包括启动子、5’非编码区(5’UTR)、编码区(CDS)或非编码RNA区(Non-codingRNA)、3’非编码区(3’UTR)、终止子等多个元件。非编码RNA在RNA水平上就能行使其生物学功能，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA。CDS区域包含外显子和内含子，转录出来的RNA翻译成蛋白之后，不同区段的氨基酸通常会形成不同的结构域(domain)，特异的结构域决定了蛋白的细胞内定位和功能(如核定位信号、叶绿体导肽、线粒体导肽、DNA结合结构域、转录激活结构域、酶催化中心等)。对于非编码RNA来讲，不同的区段也具有不同的功能。当基因的一个或几个元件发生变化，就会形成一个新的基因，可能产生新的功能。例如蟠桃中的PpOFP1基因上游发生一个1.7Mb的染色体片段倒位事件，形成新的启动子，在果实...
【技术保护点】
1.一种在生物体内创制新基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n在生物体基因组中至少两个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，其中所述特定位置是能够分割不同基因元件或不同蛋白结构域的基因组位点，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生所述不同基因元件或不同蛋白结构域之间不同于原始基因组序列的新组合，形成新基因。/n
【技术特征摘要】
20191106 CN 20191107340611.一种在生物体内创制新基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在生物体基因组中至少两个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，其中所述特定位置是能够分割不同基因元件或不同蛋白结构域的基因组位点，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生所述不同基因元件或不同蛋白结构域之间不同于原始基因组序列的新组合，形成新基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的“至少两个不同的特定位置”可以位于同一条染色体上，也可以位于不同染色体上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的“至少两个不同的特定位置”可以在至少两个不同基因上的特定位置，也可以在同一基因上的至少两个不同的特定位置。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的“至少两个不同基因”的转录方向可以相同，也可以不同。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，所述的“DNA断裂”是通过将具有靶向特性的核酸酶递送到生物体细胞内与基因组DNA特定位置接触实现的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的“具有靶向特性的核酸酶”为Meganuclease、Zincfingernuclease、TALEN或CRISPR/Cas系统。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述“具有靶向特性的核酸酶”以DNA形式存在。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述“具有靶向特性的核酸酶”以mRNA或蛋白形式存在，而非DNA形式。
9.根据权利要求5-8任意一项所述的方法，其特征在于，将具有靶向特性的核酸酶递送到细胞内的方法选自1)PEG介导的细胞转染的方法；2)脂质体介导的细胞转染的方法；3)电击转化的方法；4)显微注射；5)基因枪轰击；或6)农杆菌介导的转化方法。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于，所述“基因元件”包括基因的启动子、5’非编码区、编码区或非编码RNA区、3’非编码区和终止子。
11.根据权利要求1-10任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合为两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子和另一基因的编码区或非编码RNA区的组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合中一个为生物内源强启动子，另外一个为HPPD、EPSPS、PPO或GH1基因编码区。
13.根据权利要求1-10任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合为两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子至5’非编码区和另一基因的编码区或非编码RNA区的组合。
14.根据权利要求11或13所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达水平强弱的差异。
15.根据权利要求11或13所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达组织特异性的差异。
16.根据权利要求11或13所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达发育时期特异性的差异。
17.根据权利要求1-10任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合为同一基因内相邻基因元件的组合。
18.根据权利要求1-17任意一项所述的方法，其特征在于，所述“蛋白结构域”是指对应于蛋白质特定功能结构域的DNA片段；优选地，包括核定位信号、叶绿体导肽、线粒体导肽、磷酸化位点、甲基化位点、跨膜结构域、DNA结合结构域、转录激活结构域、受体激活结构域或酶催化中心。
19.根据权利要求1-18任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同蛋白结构域的组合为两个具有不同亚细胞定位的蛋白编码基因其中之一的定位信号区域和另一基因的成熟蛋白编码区域的组合。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述“不同亚细胞定位”包括核定位、胞质定位、细胞膜定位、叶绿体定位、线粒体定位或内质网膜定位。
21.根据权利要求1-18任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同蛋白结构域的组合为两种不同生物学功能的蛋白结构域的组合。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述“不同生物学功能”包括识别特异DNA或RNA保守序列、激活基因表达、结合蛋白配体、结合小分子信号、离子结合或特异的酶促反应。
23.根据权利要求1-18任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同蛋白结构域的组合为同一基因内相邻蛋白结构域的组合。
24.根据权利要求1-10和18任意一项所述的方法，其特征在于，所述基因元件和蛋白结构域的组合为同一基因内蛋白结构域与相邻的启动子、5’非编码区、3’非编码区或终止子的组合。
25.根据权利要求1-24任意一项所述的方法，其特征在于，所述的生物体是动物、植物或真菌。
26.一种采用权利要求1-25任意一项所述方法获得的新基因。
27.根据权利要求26所述的新基因，其特征在于，所述的新基因与原基因相比，或具有不同启动子并因此具有了不同时空或不同强度或不同发育时期的表达特性，或具有了新的氨基酸序列；优选地，所述的“新的氨基酸序列”，即可以是两个以上基因编码区的整体融合，也可以是编码区的部分融合或同一基因部分蛋白编码区的加倍。
28.根据权利要求26或27所述的新基因，其特征在于，所述新基因为高表达生物内源HPPD、EPSPS、PPO或GH1基因。
29.一种包含权利要求26-28任意一项所述基因的DNA。
30.一种利用包含权利要求26-28任意一项所述基因编码的蛋白或其生物活性片段。
31.一种重组表达载体，其包含权利要求26-28任意一项所述的基因，以及与之可操作地连接的启动子。
32.一种包含权利要求26-28任意一项所述基因的表达盒。
33.一种宿主细胞，其中包含有权利要求32所述的表达盒；优选地，所述宿主细胞是植物细胞、动物细胞或真菌细胞。
34.采用权利要求33所述宿主细胞再生成的生物。
35.一种如权利要求26-28任意一项所述的基因在赋予或提高生物体抗性/耐受性性状或生长优势性状上的应用。
36.一种组合物，其包含：
(a)两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子和另一基因的编码区或非编码RNA区；
(b)两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子至5’非编码区和另一基因的编码区或非编码RNA区；
(c)同一基因内相邻基因元件；
(d)两个具有不同亚细胞定位的蛋白编码基因其中之一的定位信号区域和另一基因的成熟蛋白编码区域；
(e)两种不同生物学功能的蛋白结构域；
(f)同一基因内相邻蛋白结构域；或者，
(g)同一基因内蛋白结构域与相邻的启动子、5’非编码区、3’非编码区或终止子。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达水平强弱的差异。
38.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述“不同表达模式”为基因表达组织特异性的差异。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜临建，王继尧，莫苏东，陈波，李华荣，
申请(专利权)人：青岛清原化合物有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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