一种天然β2-微球蛋白的提取方法技术

本发明专利技术公开一种天然β2‑微球蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤S1、原料的粗处理：步骤S2、盐析：步骤S3、离子交换层析：(1)将样品加入截流分子量8000‑10000的透析袋中，之后将PEG20000涂覆在透析袋外表面，在3‑5℃的温度下对样品进行浓缩5mg/mL以上，之后过QSepharoseFF柱，用0.1‑0.7M氯化钠梯度洗脱；步骤S4、凝胶过滤层析：本发明专利技术使用到的β2‑微球蛋白来源于病人尿液，制备出的蛋白为天然蛋白，具有更好的免疫原性；提取出的β2‑微球蛋白纯度与收率更高；本发明专利技术所使用到的纯化方法有效的保持了目的蛋白的结构和功能。

【技术实现步骤摘要】
一种天然β2-微球蛋白的提取方法
本专利技术属于生物
，具体为一种天然β2-微球蛋白的提取方法。
技术介绍
β2-微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。血清β2-微球蛋白的升高可反映肾小球滤过功能受损或滤过负荷是否增加的情况；尿液中排出β2-微球蛋白增高，则提示肾小管损害或滤过负荷增加。因此β2-微球蛋白在血液及尿中含量的测定对肾脏疾病的鉴别诊断有重要价值。目前制备的天然来源β2-微球蛋白的原料为肾病相关患者或肾移植人员的尿液，除了单抗亲和层析的工艺，其余工艺一般较为繁杂且纯度与得率很难兼顾。在此利用盐析、离子交换、凝胶过滤层析的方法从肾移植人员尿液中提取β2-微球蛋白，并将其作为后期制备单抗的免疫原。
技术实现思路
为了克服上述的技术问题，本专利技术提供一种天然β2-微球蛋白的提取方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种天然β2-微球蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤S1、原料的粗处理：(1)收集肾移植人员尿液，离心，控制离心的转速是10000rpm，离心时间为30min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置15min，收集上清组分；(2)向收集的上清组分中加入乙二胺四乙酸和硫柳汞钠，以100-300rpm的转速匀速搅拌30min，制得处理后的上清组分，备用；步骤S2、盐析：(1)向处理后的上清组分中加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为20-25％，以2000-3000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集上清，备用；(2)向收集的上清中加入加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为40-60％，以2000-3000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集沉淀，备用；(3)将收集的沉淀加入pH7.8，浓度为10mM的PBS缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在PBS缓冲液中透析，制得样品；步骤S3、离子交换层析：(1)将样品加入截流分子量8000-10000的透析袋中，之后将PEG20000涂覆在透析袋外表面，在3-5℃的温度下对样品进行浓缩5mg/mL以上，之后过QSepharoseFF柱，控制流速为1mL/min，用0.1-0.7M氯化钠梯度洗脱；(2)收集含有目的蛋白的洗脱后的样品，并将含有目的蛋白的洗脱后的样品透析在pH7.8，含有0.6MNaCl的20mMPB缓冲液中；步骤S4、凝胶过滤层析：(1)将Superdex75按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的Superdex75凝胶，之后将Superdex75凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；(2)之后使用pH7.8，浓度为10mM的PBS缓冲液洗脱，控制洗脱的流速为1mL/min；(3)洗脱结束后分管收集并电泳，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用pH＝7.2，浓度为10mM的PBS缓冲液透析并冷冻保存。进一步地，所述pH7.8，浓度为10mM的PBS缓冲液由如下方法制成：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g加入800mL双蒸水中，用浓度为0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，直至pH7.8，之后高压蒸汽灭菌，在30-35℃下保存，制得pH＝7.8，浓度为10mM的PBS缓冲液。进一步地，步骤S4中电泳的条件为：在恒流条件下，控制最大电压为300V，分离胶内电流为10mA，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20-25mA，控制电泳时间为2h。进一步地，步骤S1中控制乙二胺四乙酸和硫柳汞钠的重量比为1-5∶1，乙二胺四乙酸和硫柳汞钠重量和为上清组分的0.01-0.1％。本专利技术的有益效果：1、本专利技术使用到的β2-微球蛋白来源于病人尿液，制备出的蛋白为天然蛋白，具有更好的免疫原性；2、本专利技术提取出的β2-微球蛋白纯度与收率更高；3、本专利技术所使用到的纯化方法有效的保持了目的蛋白的结构和功能。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种天然β2-微球蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤S1、原料的粗处理：(1)收集肾移植人员尿液，离心，控制离心的转速是10000rpm，离心时间为30min，离心温度为4℃，离心结束后静置15min，收集上清组分；(2)向收集的上清组分中加入乙二胺四乙酸和硫柳汞钠，以100rpm的转速匀速搅拌30min，制得处理后的上清组分，备用，控制乙二胺四乙酸和硫柳汞钠的重量比为1∶1，乙二胺四乙酸和硫柳汞钠重量和为上清组分的0.1％；步骤S2、盐析：(1)向处理后的上清组分中加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为20％，以2000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集上清，备用；(2)向收集的上清中加入加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为40％，以2000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集沉淀，备用；(3)将收集的沉淀加入pH7.8，浓度为10mM的PBS缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在PBS缓冲液中透析，制得样品；步骤S3、离子交换层析：(1)将样品加入截流分子量10000的透析袋中，之后将PEG20000涂覆在透析袋外表面，在4℃的温度下对样品进行浓缩5mg/mL以上，之后过QSepharoseFF柱，控制流速为1mL/min，用0.1-0.7M氯化钠梯度洗脱；(2)收集含有目的蛋白的洗脱后的样品，并将含有目的蛋白的洗脱后的样品透析在pH7.8，含有0.6MNaCl的20mMPB缓冲液中；步骤S4、凝胶过滤层析：(1)将Superdex75按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的Superdex75凝胶，之后将Superdex75凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；(2)之后使用pH7.8，浓度为10mM的PBS缓冲液洗脱，控制洗脱的流速为1mL/min；(3)洗脱结束后分管收集并电泳，在恒流条件下，控制最大电压为300V，分离胶内电流为10mA，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20mA，控制电泳时间为2h，电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种天然β2-微球蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤S1、原料的粗处理：/n(1)收集肾移植人员尿液，离心，控制离心的转速是10000rpm，离心时间为30min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置15min，收集上清组分；/n(2)向收集的上清组分中加入乙二胺四乙酸和硫柳汞钠，以100-300rpm的转速匀速搅拌30min，制得处理后的上清组分，备用；/n步骤S2、盐析：/n(1)向处理后的上清组分中加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为20-25％，以2000-3000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集上清，备用；/n(2)向收集的上清中加入加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为40-60％，以2000-3000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集沉淀，备用；/n(3)将收集的沉淀加入pH7.8，浓度为10mM的PBS缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在PBS缓冲液中透析，制得样品；/n步骤S3、离子交换层析：/n(1)将样品加入截流分子量8000-10000的透析袋中，之后将PEG20000涂覆在透析袋外表面，在3-5℃的温度下对样品进行浓缩5mg/mL以上，之后过Q Sepharose FF柱，控制流速为1mL/min，用0.1-0.7M氯化钠梯度洗脱；/n(2)收集含有目的蛋白的洗脱后的样品，并将含有目的蛋白的洗脱后的样品透析在pH7.8，含有0.6M NaCl的20mM PB缓冲液中；/n步骤S4、凝胶过滤层析：/n(1)将Superdex 75按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的Superdex 75凝胶，之后将Superdex 75凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；/n(2)之后使用pH7.8，浓度为10mM的PBS缓冲液洗脱，控制洗脱的流速为1mL/min；/n(3)洗脱结束后分管收集并电泳，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用pH7.2，浓度为10mM的PBS缓冲液透析并冷冻保存。/n...

【技术特征摘要】
1.一种天然β2-微球蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、原料的粗处理：
(1)收集肾移植人员尿液，离心，控制离心的转速是10000rpm，离心时间为30min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置15min，收集上清组分；
(2)向收集的上清组分中加入乙二胺四乙酸和硫柳汞钠，以100-300rpm的转速匀速搅拌30min，制得处理后的上清组分，备用；
步骤S2、盐析：
(1)向处理后的上清组分中加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为20-25％，以2000-3000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集上清，备用；
(2)向收集的上清中加入加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为40-60％，以2000-3000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集沉淀，备用；
(3)将收集的沉淀加入pH7.8，浓度为10mM的PBS缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在PBS缓冲液中透析，制得样品；
步骤S3、离子交换层析：
(1)将样品加入截流分子量8000-10000的透析袋中，之后将PEG20000涂覆在透析袋外表面，在3-5℃的温度下对样品进行浓缩5mg/mL以上，之后过QSepharoseFF柱，控制流速为1mL/min，用0.1-0.7M氯化钠梯度洗脱；
(2)收集含有目的蛋白的洗脱后的样品，并将含有目的蛋白的洗脱后的样品透析在pH7.8，含有0.6MNaCl的20mMPB缓冲液中；
步骤S4、凝胶过滤层析：
(1)将Su...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵杰，张磊，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34