柠檬苦素在制备延缓及治疗骨关节炎药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种柑橘类提取物柠檬苦素(Lim)的应用，特别涉及Lim用于制备延缓及治疗软骨损伤相关疾病药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
柠檬苦素在制备延缓及治疗骨关节炎药物中的应用
本专利技术涉及一种柑橘类提取物柠檬苦素(Lim)的应用，特别涉及Lim用于制备延缓及治疗软骨损伤相关疾病药物中的应用。
技术介绍
骨关节炎(OA)也称为退行性关节炎，主要发生于老年人，是常见的骨科疾病之一。调查报告显示，膝骨关节炎的患病率急剧上升，给家庭和国家造成了巨大的经济负担。骨关节炎的病程进展缓慢,主要发生在髋关节和膝关节，其主要症状是关节痛和运动受限。尽管已鉴定出多种因素可导致骨关节炎，包括年龄，性别，创伤，肥胖和遗传，但OA的发病机制仍不清楚。疼痛是OA的最主要表现，其主要病理变化是软骨下骨和滑膜变性。但是目前的药物只能改善OA的症状，并伴有许多副作用.因此，找到一种可以逆转OA且副作用最小的药物至关重要。柠檬苦素(Lim)是一种高度氧化的三萜类化合物，广泛用于膳食补充剂中，主要从橘子水果中提取，包括橘子，橙子，橙子和葡萄柚等。柠檬苦素具有广泛的生物学和药理特性，例如抗炎，抗氧化剂，抗肿瘤，抗菌和镇痛作用，然而，Lim是否可能对软骨损伤、骨关节炎等骨科疾病的进展有治疗作用仍不清楚。
技术实现思路
本专利技术发现，柠檬苦素(Lim)对骨关节炎(OA)骨科疾病具有明显的治疗作用，为此，本专利技术的目的是提供一种柠檬苦素(Lim)在制备用于治疗骨科疾病中的应用。相比西药较大的副作用，Lim作为一种中药，可以更加温和地缓解骨关节炎。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种柠檬苦素在制备治疗骨科疾病药物中的应用，所述Lim结构式为式(Ⅰ)所示：进一步，所述骨科疾病包括骨关节炎、滑膜炎、椎间盘退变、组织损伤症。进一步，所述骨关节炎为髋骨关节炎和膝骨关节炎。进一步，所述骨关节炎为软骨损伤性骨关节炎。进一步，所述骨关节炎为失稳性骨关节炎。进一步，所述药物为片剂、乳剂或胶囊等。进一步，所述药物还包括药用载体，所述药用载体为微乳、纳米脂质体等。进一步，所述药用载体为油酸乙酯微乳时，所述药物中柠檬苦素的含量为30-40mg；所述药用载体为纳米脂质体时，所述药物中柠檬苦素的含量为30-40mg；所述柠檬苦素的用量为体重30-40mg。与现有技术相比，本专利技术有益效果体现在：柠檬苦素(Lim)作为一种食物提取物，其在抑制软骨细胞炎症，基质失稳态方面具有明显的疗效。柠檬苦素具有毒性低，效果明显的特点，可以为骨科疾病，尤其是软骨损伤症、骨关节炎等疾病的综合治疗提供一种替代治疗药物。附图说明图1为Lim在软骨细胞中细胞毒性和细胞保护作用。(A)Lim的化学结构；(B)不同浓度的Lim的细胞毒性作用；(C，D)不同浓度的Lim下对抗氧化的保护作用。图2为在诱导的软骨细胞中Lim抑制基质降解的作用。(A-C)基质合成和分解相关蛋白印迹试验的对照图(Aggrecan、ADAMTS5、MMP3和MMP13)和定量统计图；(D-E)基质合成相关蛋白(胶原蛋白II，COL2)荧光染色图和定量统计图。图3为在小鼠体内模型中Lim延缓骨关节炎的发展。(A)不同实验组(Sham组、DMM组、DMM+Lim组)的小鼠膝关节X线片；(B，C)不同实验组中SO染色及软骨评分和滑膜炎评分；(D,E)不同实验组中免疫组化的试验对照图和定量统计图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：1、实验步骤：(1)用戊巴比妥过量处死两周大的小鼠(C57BL/6)。在无菌条件下，采取膝关节的关节软骨并用无菌刀片切碎。接下来，将它们用PBS洗涤3次，然后在37℃的培养箱中暴露于II型胶原酶(0.2％)中4小时。以3000rpm离心消化的软骨组织5分钟，吸出上清液，然后将沉淀物重悬于培养箱中的DMEM/F12和FBS(10％)和青霉素/链霉素抗生素(1％)的软骨细胞中，并保持培养箱在37℃的CO2(5％)下。当软骨细胞达到80％～90％汇合时，用胰蛋白酶-EDTA(0.25％)收集细胞。然后将细胞播种到适当浓度(每毫升约1×105个细胞)的10cm2Petri皿中。48小时后，通过添加新鲜培养基替换培养基。为了减少实验错误，我们使用第二代软骨细胞。(2)根据制造商的说明，CCK-8试剂盒用于鉴定柠檬苦素软骨细胞活性的影响。将第二代软骨细胞接种在96孔板(8000个细胞/孔)中，然后将其暴露于各种浓度的柠檬苦素(即0、15、30、60、120M)中一或两天。然后，每个孔用10μlCCK-8处理并在37℃下再孵育2小时。接下来，使用分光光度计(ThermoFisher)记录O.D的密度。在450nm所有测定重复三次。(3)Westernblot步骤：软骨细胞(小鼠)总蛋白的分离用包含PMSF(苯基甲磺酰氟，1mM)的RIPA裂解缓冲液进行。接着，将混合物在4℃以12000rpm离心15分钟，并将裂解物在冰上放置10分钟。随后通过使用BCA蛋白质检测试剂盒(Beyotime)评估蛋白质浓度。SDSPAGE用于分离蛋白质，PVDF膜用于转移40ng蛋白，然后用脱脂牛奶(5％)阻塞膜2个小时，并用一抗孵育膜24个小时。在4℃时，即COX-2，p65，II型胶原，iNOS聚集蛋白聚糖，MMP-13，Nrf2，ADAMTS-5，HO-1，IκBα和LaminB1的比例相同，即1：1000，而GADPH为1：3000比率接下来，将TBST用于膜洗涤。然后在约25℃下用特异性二抗进行2小时膜温育。电化学发光加试剂用于在TBST洗涤3次后观察印迹。最终，使用成像系统(Bio-Rad)对下划线的印迹强度进行可视化。(4)细胞免疫荧光：使用玻璃盖玻片将软骨细胞播种在6孔板上，然后将细胞暴露于IL-1β(10ng/mL)或与10ngml-1IL-1β和60μM柠檬苦素共同处理过夜在与缺乏血清的培养基一起温育24小时后的培养基中。然后用PBS三次洗涤单层软骨细胞的玻璃盖玻片，然后在约25℃下用低聚甲醛(4％)固定细胞15分钟，然后再次用PBS冲洗。TritonX-100(0.1％)在约25℃下用于细胞和核膜通透性5分钟。接下来，在37℃下用BSA(5％)封闭细胞60分钟，用PBS洗涤，然后与一抗孵育：胶原II(1：200)，MMP13(1：200)，p65(1：200)和Nrf2(1：200)在4℃下放置24小时。然后将细胞与488标记的或594偶联的二抗(1：400)在PBS洗涤后于25℃孵育60分钟。随后用DAPI(Invitrogen)标记细胞1分钟。共聚焦激光扫描显微镜用于载玻片的成像。通过ImageJ软件2.1(Bethesda，MD，USA)评估荧光强度。(6)实时PCR步骤：通过TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA(软骨细胞)，并用不同浓度的柠檬苦素通过IL-1β(10ng/ml)刺激。同样，通过逆转录酶，在总RNA(1000ng)的帮助下生成了cDNA。对于定量RT-PCR(qPCR)，使用2xSYBRMast本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.柠檬苦素在制备治疗骨科疾病药物中的应用，所述Lim结构式为式(Ⅰ)所示：/n

【技术特征摘要】
1.柠檬苦素在制备治疗骨科疾病药物中的应用，所述Lim结构式为式(Ⅰ)所示：





2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨科疾病包括骨关节炎、滑膜炎、椎间盘退变和组织损伤症。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述骨关节炎为髋骨关节炎或膝骨关节炎。


4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述骨关节炎为软骨损伤性骨关节炎。


5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小磊，金杰，任呈豪，陈西淼，黄卓颖，朱晓辉，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33