基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒，有捕获试剂、检测缓冲液及试纸，捕获试剂为生物素化偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP；检测缓冲液为50 mM Tris‑base，0.15 M NaCl，0.01% Tween‑20及7.5% BSA；试纸有底板，在底板上从左至右依次呈阶梯状地固接有加样垫、荧光微球偶联释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，荧光微球偶联释放垫由铕荧光纳米颗粒与链酶亲和素SA和兔IgG的偶联液喷射在聚酯纤维上制备而成；硝酸纤维素膜上由左到右依次设置有由UMOD单抗构成的检测带和由羊抗兔IgG构成的参照带。

【技术实现步骤摘要】
基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒
本专利技术属于生物医学检测
，尤其涉及一种基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒。
技术介绍
尿路上皮癌是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一。“早发现，早诊断，早治疗”是目前尿路上皮癌诊断和治疗的重要发展方向和最有效手段，可显著提高患者生存率。尿路上皮癌包括肾盂癌、膀胱癌、输尿管癌等，现有临床上常用的检查方法有尿液脱落细胞学检查，影像学检查等。尿液脱落细胞学检查的主要标记物是Neu5Gc（N-羟乙酰神经氨酸），检测原理是基于糖链抗体之间的特异性反应，但是由于Neu5Gc存在于除了人和鸡以外的所有哺乳动物体内，对小鼠来说无法引起强烈的免疫应答，因此成功制备单抗的难度较大；虽然Neu5Gc可以诱导鸡产生IgY抗体，但属于多抗，故以Neu5Gc作为癌症标记物特异性较差。研究表明唾液酸是细胞膜糖蛋白修饰的重要组成部分，已有关于唾液酸修饰UMOD（尿调素）的相关报道，如《尿调素的结构解析及其在人尿路感染时的功能研究》（Citedas:WeissGregorL,StanisichJessicaJ,SauerMaximilianMetal.Architectureandfunctionofhumanuromodulinfilamentsinurinarytractinfections.[J].Science,2020,369:1005-1010.），该文章的补充材料的实验方法中，公开人尿液中唾液酸修饰UMOD的制备方法，即以硅藻土纯化膀胱癌患者尿液制备Neu5Gc修饰的UMOD糖蛋白。同时文中表明唾液酸修饰UMOD具有促进大肠杆菌凝集，抑制尿道细菌感染的功能。中国专利号为201310501366.2，名称为“七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用”公开了七鳃鳗免疫蛋白LIP的制备方法。已证明LIP对肿瘤细胞具有独特地识别和选择性杀伤的功能（Citedas:PangYue,LiChangzhi,WangShiyueetal.Anovelproteinderivedfromlampreysupraneuralbodytissuewithefficientcytocidalactionsagainsttumorcells.[J].CellCommunSignal,2017,15:42.）。同时亦有LIP可特异性识别肿瘤细胞膜表面脂筏结构上以Neu5Gc末端修饰的糖型结构的报道（Citedas:PangYue,GouMeng,YangKaietal.Crystalstructureofacytocidalproteinfromlampreyanditsmechanismofactionintheselectivekillingofcancercells.[J].CellCommunSignal,2019,17:54.）。但是，迄今为止并没有以唾液酸修饰UMOD为标记物而专利技术的基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒。本专利技术的技术解决方案是：一种基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒，有捕获试剂、检测缓冲液及试纸，其特征在于：所述捕获试剂为生物素化偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP，所述检测缓冲液为50mMTris-base，0.15MNaCl，0.01%Tween-20及7.5%BSA，所述试纸有底板，在底板上从左至右依次呈阶梯状地固接有加样垫、荧光微球偶联释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述荧光微球偶联释放垫由铕荧光纳米颗粒与链酶亲和素SA和兔IgG的偶联液喷射在聚酯纤维上制备而成，所述硝酸纤维素膜上由左到右依次设置有由UMOD单抗构成的检测带和由羊抗兔IgG构成的参照带。所述生物素化偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP按照如下方法制备：将浓度为0.5mg/mL的七鳃鳗免疫蛋白LIP水溶液置于试管后加入生物素，室温条件下，充分混匀得到混合液，所述七鳃鳗免疫蛋白LIP的水溶液与生物素的用量比为1mL：2mg；将混合液经脱盐柱纯化，得到生物素化偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP。所述链酶亲和素SA和兔IgG包被的荧光微球偶联液依次按照如下步骤制备：a.制备活化羧基化铕荧光纳米微球；b.取活化羧基化铕荧光纳米微球、链酶亲和素SA及兔IgG混合，再加入偶联缓冲液将活化羧基化铕荧光纳米微球稀释至2mg/mL，在37℃条件下反应2h，所述活化羧基化铕荧光纳米微球、链酶亲和素SA及兔IgG的体积比为2：3：0.5，所述链酶亲和素SA的浓度为1.41mg/mL，所述兔IgG浓度为5mg/mL；c.将反应液在4℃，15000×g条件下离心15min，取沉淀A；d.向沉淀A中加入洗涤液，超声重悬，在4℃，15000×g条件下离心15min，取沉淀B；e.向沉淀B中加入封闭液，超声重悬后混匀，得微球悬浮溶液；f.将微球悬浮溶液在4℃，15000×g条件下离心15min，取沉淀C；g.向沉淀C中加入保存液，超声重悬，在4℃，15000×g条件下离心15min，取沉淀D；h.将沉淀D用保存液稀释至2mg/mL即可；所述保存液中的组分为25mmol/L的Tris-base、0.15mol/L的氯化钠、质量浓度为1%的胎牛白蛋白，质量浓度0.05％的吐温-20和质量浓度5%的海藻糖，溶剂为双蒸水，pH7.8。本专利技术所用兔IgG可由鼠IgG替代，当采用鼠IgG时，对应采用羊抗鼠IgG构成参照带。本专利技术是以唾液酸修饰UMOD为标记物、基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒，即通过LIP与尿液中修饰UMOD糖蛋白的Neu5Gc结合，结合物中的Neu5Gc修饰UMOD与被预先包被在检测带上的UMOD单抗结合，可准确检测尿液中修饰UMOD的Neu5Gc含量，进而区分正常人、良性疾病（炎症，囊肿等良性肿瘤）和尿路上皮癌。具有操作简单、高灵敏度和特异性等优点，可快速进行大量样本的筛查，具有良好的临床标本检测能力。附图说明图1是应用本专利技术实施例检测不同人尿液的结果示意图。图2是应用本专利技术实施例检测各分期膀胱癌患者尿液的结果示意图。具体实施方式本专利技术的基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒，有捕获试剂、检测缓冲液及试纸，所述捕获试剂为生物素化偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP；所述检测缓冲液为50mMTris-base，0.15MNaCl，0.01%Tween-20及7.5%BSA；所述试纸有底板，在底板上从左至右依次呈阶梯状地固接有加样垫、荧光微球偶联释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述荧光微球偶联释放垫由铕荧光纳米颗粒与链酶亲和素SA和兔IgG的偶联液喷射本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒，有捕获试剂、检测缓冲液及试纸，其特征在于：所述捕获试剂为生物素化偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP，所述检测缓冲液为50 mM Tris-base，0.15 M NaCl，0.01% Tween-20及7.5% BSA，所述试纸有底板，在底板上从左至右依次呈阶梯状地固接有加样垫、荧光微球偶联释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述荧光微球偶联释放垫由铕荧光纳米颗粒与链酶亲和素SA和兔IgG的偶联液喷射在聚酯纤维上制备而成，所述硝酸纤维素膜上由左到右依次设置有由UMOD单抗构成的检测带和由羊抗兔IgG构成的参照带。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒，有捕获试剂、检测缓冲液及试纸，其特征在于：所述捕获试剂为生物素化偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP，所述检测缓冲液为50mMTris-base，0.15MNaCl，0.01%Tween-20及7.5%BSA，所述试纸有底板，在底板上从左至右依次呈阶梯状地固接有加样垫、荧光微球偶联释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述荧光微球偶联释放垫由铕荧光纳米颗粒与链酶亲和素SA和兔IgG的偶联液喷射在聚酯纤维上制备而成，所述硝酸纤维素膜上由左到右依次设置有由UMOD单抗构成的检测带和由羊抗兔IgG构成的参照带。


2.根据权利要求1所述基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂盒，其特征在于所述生物素化偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP按照如下方法制备：将浓度为0.5mg/mL的七鳃鳗免疫蛋白LIP水溶液置于试管后加入生物素，室温条件下，充分混匀得到混合液，所述七鳃鳗免疫蛋白LIP的水溶液与生物素的用量比为1mL：2mg；将混合液经脱盐柱纯化，得到生物素化偶联的七鳃鳗免疫蛋白LIP。


3.根据权利要求1或2所述基于LIP识别尿液中修饰UMOD的Neu5Gc检验尿路上皮癌的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：逄越，李庆伟，滕洪明，
申请(专利权)人：辽宁师范大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21