用于检测小麦小穗数着生密度的KASP引物组及其应用制造技术

本发明专利技术提供一组检测小麦小穗数着生密度的KASP引物组及其应用，所述KASP引物组KASP引物组包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的共用引物1，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的引物2，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物3；以该KASP引物组为引物，以待测小麦基因组为模板进行PCR扩增，若扩增结果显示待测小麦基因分型与扬麦15相同，则该待测小麦含有等位基因T；反之，则待测小麦含有等位基因C；含有等位基因T的小麦小穗数着生密度高于含有等位基因C的小麦；该检测方法可快速而直观获得小麦品种小穗数着生密度高低的结果，适用于大规模育种筛查。

【技术实现步骤摘要】
用于检测小麦小穗数着生密度的KASP引物组及其应用
本申请涉及小麦育种领域，特别是一组用于检测小麦小穗着生密度高低的KASP引物组及其应用。
技术介绍
小麦是世界主要的粮食作物之一，小麦产量与小麦穗部性状高度相关，性状间关系错综复杂，小麦穗部性状主要是小穗数、穗长、小穗着生密度、穗粒数、穗粒重等，其中穗长、小穗着生密度、穗粒数、穗粒重是由主基因与微效多基因共同控制，而小穗数由多基因控制，无主基因存在。小麦小穗着生密度是指单位穗长的着生小穗数量(小穗着生密度＝单个穗子的总小穗数/穗长)，其与小麦籽粒产量密切相关，小穗着生密度高的小麦品种结实小穗数更多，更容易获得高产。田间无法直观的测定小穗着生密度，必须要先测定穗长和总小穗数，计算后才能确定小穗着生密度，因此在育种中要检测大量材料间的小穗着生密度高低需要的工作量繁重。国内外对小穗着生密度的遗传研究偏少，已有研究发现小穗着生密度主基因遗传率高达88.69％—92.14％，受环境影响小，育种中早代选择结果可靠性较高(参考文献：魏艳丽，王彬龙，李瑞国，蒋会利，张安静.大穗小麦穗部性状的遗传分析，麦类作物学报，2015,35(10):1366-1371)，分别在1A、3A、2D、4B、4D、6B、6D等染色体上(参考文献：刘凯，邓志英，李青芳，张莹，孙彩铃，田纪春，陈建省.利用高密度SNP遗传图谱定位小麦穗部性状基因，中国农业科学，2016，42(6)：820-831；)。分子标记辅助选择育种可在DNA水平针对目标性状进行选择，不仅结果稳定，而且可在苗期进行选择，操作简便，有利于育种早代选择。单核苷酸多态性(SNP)标记具有遗传稳定、数量多、分布广且易于检测等特点，适合于数量庞大的检测分析，目前市场中已存在多种适用于不同动植物的SNP芯片，在遗传育种中发挥十分重要的作用。通过遗传分析挖掘到重要性状的连锁标记后，需要将其转化为易于使用的分子标记。KompetitiveAlleleSpecificPCR(KASP)标记技术通过荧光探针，可以将SNP标记的不同等位变异区分，通量高、快速、稳定，是一种育种使用便捷的分子标记。扬麦15和扬麦13均是江苏里下河地区农业科学研究所育成的小麦品种，扬麦15粒重高、株高矮，产量高，相比而言，扬麦13株高偏高，粒重与产量与扬麦15相当，而且两者均是全国少有的优质弱筋小麦，经过多年性状考察发现，扬麦15的小穗着生密度是1.85个/cm—1.95个/cm，扬麦13的小穗着生密度是1.60个/cm—1.70个/cm，而普通小麦的小穗着生密度是1.65—1.75个/cm，扬麦15呈现的是显著的高于普通小麦和扬麦13的小穗着生密度，因此挖掘扬麦15控制小穗着生密度的主效QTL并开发成可供育种使用的连锁分子标记对于分子标记辅助选择小穗着生密度高低的小麦育种工作十分重要。目前暂未有对扬麦15小穗着生密度的遗传基础的公开研究报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术，利用illumina90K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于扬麦15的1个与小穗着生密度相关的主效QTL位点YM15-SC-5A，其紧密连锁标记是RAC875_c8690_446，并据此开发了1个KASP标记引物组Y15-SC-KASP，用以对小穗着生密度高低进行高效筛选，本专利技术是通过如下方案实现的：本专利技术首先提供了与小麦小穗着生密度相关的KASP引物组，该引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的引物1(共用上游引物)，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的引物2(下游引物)，以及核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物3(下游引物)；上述KASP引物组可特异性检测5A染色体上的标记RAC875_c8690_446。其次，本申请还提供了核苷酸序列如SEQIDNO.1—SEQIDNO.3所示的KASP引物组在鉴定小穗着生密度中的应用。进一步而言，上述KASP引物组可特异性检测在鉴定小穗着生密度中的应用是指，以待测小麦基因组DNA为模板，利用KASP引物组Y15-SC-KASP为引物进行PCR扩增，PCR扩增同时加入扬麦15的DNA作为对照，然后利用多功能酶标仪检测PCR扩增产物并用KlusterCaller软件(KBioscience)对5A染色体上144.40—145.70CM处的标记RAC875_c8690_446进行基因分型，根据分析结果确定小穗着生密度相关位点连锁的SNP标记RAC875_c8690_446的基因型(其对应变异的位点是T/C)；若基因分型结果与扬麦15相同，则携有优势等位基因T，反之，则携有等位基因C，含有等位基因T的小麦小穗着生密度高于含有等位基因C的小麦。因此将其转化为成简易、高通量的KASP(KompetitiveallelespecificPCR，http://www.lgcgroup.com/kasp)标记(PolyMarker，http://polymarker.tgac.ac.uk/)YM15-SC-KASP引物组，利于区分优势等位基因和非优势等位基因。进一步而言，上述样品小麦优选同一生态区种植的小麦。进一步而言，上述步骤所述的PCR检测是指：KASP标记引物工作液的制备：分别取上游引物(核苷酸序列如SEQIDNO.1)30μL(100μM)，下游引物(核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示)各12μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用；PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.08μL、KASPMasterMix2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；PCR反应程序：第一步，95℃预变性15min；第二步，95℃变性20s、65–57℃(每个循环下降1℃)60s，共9个循环；第三步，95℃变性20s、57℃复性1min，32个循环；10℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA(参考文献：StaceyJ,IsaacPG.IsolationofDNAfromplants.MethodsMol.Biol.1994,28:9–15.)具体检测方法为：以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、PCR试剂进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在S1000TMThermalCyclerPCR仪(Bio-RadLaboratoriesInc.)上进行，用多功能酶标仪(PHERAstarPlus,BMGLABTECH，Germany)对PCR扩增产物进行扫描读取荧光值。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。采用KlusterCaller软件(KBioscience)进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 用于检测用于检测小麦小穗着生密度的KASP引物组，其特征在于，所述KASP引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物2，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物3。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测用于检测小麦小穗着生密度的KASP引物组，其特征在于，所述KASP引物组包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的引物1，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的引物2，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物3。


2.如权利要求1所述的KASP引物组在检测小麦小穗着生密度中的应用。


3.如权利要求1所述KASP引物组所特异性扩增的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指，以所述KASP引物组为引物，待测小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用多功能酶标仪检测PCR扩增产物并进行基因分型，若扩增结果显示待测小麦基因分型与扬麦15相同，则该待测小麦含有等位基因T；反之，则待测小麦含有等位基因C；含有等位基因T的小麦小穗着生密度高于含有等位基因C的小麦。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增是指：
PCR反应体系：浓度为30ng/μL的待测小麦DNA模板2μL、引物工作液0.08μL、KASPMast...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡文静，高德荣，裔新，张勇，陆成彬，张春梅，
申请(专利权)人：江苏里下河地区农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32