一种筛选内源性抗蛇毒抑制剂的亲和层析方法技术

本发明专利技术涉及一种筛选内源性抗蛇毒抑制剂的亲和层析方法，本发明专利技术所涉及的毒素蛋白亲和模式通过基质表面N‑羟基琥珀酰亚氨(NHS)与蛇毒蛋白发生共价结合，以蛇毒蛋白的特异性亲和作用吸附分离华游蛇血清的蛋白质成分。亲和层析柱制备过程简单，成本低廉；蛋白吸附量大，可以用于抗毒素蛋白的分离；对样品无特殊要求；动态吸附载量高；洗脱方便；筛选范围广，直接从蛇毒免疫的动物、蛇或其天敌动物的血浆中筛选抗毒素蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选内源性抗蛇毒抑制剂的亲和层析方法
本专利技术涉及毒素抑制剂开发领域，特别是涉及一种用于筛选未知天然毒素抑制剂亲和层析介质及其制备方法。
技术介绍
蛇毒由蛇毒腺分泌，通过排毒导管进入其毒牙鞘内，经毒牙挤压注入咬伤者体内，蛇毒具有神经毒素、肌肉毒素、血液毒素、心脏毒素，能快速地破坏人体组织，且蛇毒毒性强，对成年人致死剂量为5-25mg，因此蛇毒的致死致残率非常高。据WHO官方统计，全球每年至少有400万人被毒蛇咬伤，约12万余人因得不到及时地救治而丧失生命。但蛇和其天敌却具有广谱且强效的抗蛇毒活性，其体内的天然抗蛇毒组分尚未得到系统解析。本课题组曾从一种江西常见的无毒蛇—华游蛇血液中通过经高效液相色谱法等蛋白分离得到了一种新的有广谱抗蛇毒作用的磷脂酶A2抑制剂(saPLIγ)。但是此蛋白方法得率小，耗费时间长，且只鉴定到一种蛋白抑制剂。最近，我们给华游蛇注射了2倍LD50的五步蛇蛇毒(出血毒)、眼镜蛇蛇毒(神经毒)和蝮蛇蛇毒(混合毒)，24小时后华游蛇仍然存活，中毒症状不明显，皮下未见明显的出血斑。这说明华游蛇体内很可能存在抗出血毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毒素蛋白亲和层析介质，其特征在于，所述毒素蛋白亲和层析介质由基质表面N-羟基琥珀酰亚氨与蛇毒蛋白共价结合而成。/n

【技术特征摘要】
1.一种毒素蛋白亲和层析介质，其特征在于，所述毒素蛋白亲和层析介质由基质表面N-羟基琥珀酰亚氨与蛇毒蛋白共价结合而成。


2.如权利要求1所述的毒素蛋白亲和层析介质，其特征在于，所述基质材料为NHS琼脂糖凝胶介质。


3.一种包含如权利要求1-2任一项所述的毒素蛋白亲和层析介质的亲和层析柱。


4.如权利要求3所述的亲和层析柱的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)称取100mg五步蛇毒溶于10mL碳酸氢钠溶液中，用0.45μm滤膜过滤；
(2)取5mLNHS活化琼脂糖凝胶，用20mL盐酸洗涤，再用碳酸氢钠溶液平衡凝胶柱，将蛇毒溶液与凝胶于室温翻转混合1小时或4℃过夜结合；
(3)用至少5倍柱体积的碳酸氢钠溶液平衡凝胶柱，收集穿透液，再用乙醇胺充分洗柱以封闭胶上的未偶联的活化位点。


5.如权利要求4所述的亲和层析柱的制备方法，其特征在于，
所述碳酸氢钠溶液浓度为0.2M，pH8.3；
所述盐酸浓度为1mM；
所述步骤(3)中的乙醇胺为10mM。


6.如权利要求4所述的亲和层析柱的制备方法，其特征在于，所述毒素蛋白为5-15mg/mL，NHS活化琼脂糖凝胶和毒素蛋白的体积比为1:0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄春洪，连琪，曹利云，傅克普，陶琴琴，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36