矿化肌腱胶原在制备修复骨-肌腱连接处的药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及矿化肌腱胶原在制备修复骨‑肌腱连接处的药物中的应用；所述矿化肌腱胶原是肌腱胶原浸泡在磷酸钙纳米簇中水浴加热矿化形成矿化肌腱胶原。本发明专利技术制备得到的矿化肌腱胶原，具有良好的生物相容性和成骨诱导性等，将其用于制备修复肌腱‑骨连接处的药物中的应用，具有很大的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
矿化肌腱胶原在制备修复骨-肌腱连接处的药物中的应用
本专利技术涉及一种矿化的肌腱胶原在腱骨连接处修复的应用，属于生物材料领域。具体地，本专利技术提供了矿化肌腱胶原及其制备方法，并明确了其在制备修复骨-肌腱连接处的药物中的应用。
技术介绍
骨-肌腱连接点是肌腱、韧带或关节囊与骨相接触移行的部位,也是受力的主要部位,力通过关节从肌肉传递到骨骼，以维持身体的正常活动。肌腱-骨界面的纤维软骨区将肌腱和韧带整合到骨骼中，并在机械加载过程中吸收部分压力以此来保护肌腱。由此可见，作为机械承重连接组织的骨-肌腱连接处是较容易受到损伤；而骨-肌腱连接处发生愈合的再生能力极低，不仅如此，机械性能也较差。目前国内外对骨-肌腱连接处的治疗仍是以手术治疗为主，手术移植的肌腱和骨之间的连接处容易形成瘢痕组织界面，不仅机械性能差，而且会导致再次断裂。因此，肌腱末端与骨愈合是这个极其复杂的过程迫切需要新的修复策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种矿化肌腱胶原来修复骨-肌腱连接处从而到达有效改进骨-肌腱连接处愈合的程度与速度。本专利技术技术方案如下：本专利技术提供了矿化肌腱胶原在制备修复骨-肌腱连接处的药物中的应用；所述矿化肌腱胶原是肌腱胶原浸泡在磷酸钙纳米簇中水浴加热矿化形成矿化肌腱胶原。在上述应用中，所述的肌腱胶原与磷酸钙纳米簇的体积比为1：20～1：200。更优选地，体积比为：1：20～1：60。上述应用中，所述的骨-肌腱连接处,包括肩袖腱骨连接处或跟腱腱骨连接处等上述应用中，所述的骨-肌腱连接处，包括软骨连接，即透明软骨结合、纤维软骨结合；如椎间盘等。本专利技术还提供了一种矿化肌腱胶原，该矿化肌腱胶原由包括如下步骤的方法制备得到：步骤S1：利用冻融法脱细胞制备肌腱胶原；步骤S2:将步骤S1中所得的肌腱胶原浸泡在磷酸钙纳米簇中水浴矿化形成矿化的肌腱胶原。优选地，所述步骤S2的环境温度为20℃-45℃，更优选为37℃。优选地，磷酸钙纳米簇的浓度为1.55mg/ml～1.70mg/ml。优选地，肌腱胶原与磷酸钙纳米簇的体积比为1：20～1：200。本专利技术还提供了上述矿化肌腱胶原的制备方法，该方法包括以下步骤：步骤S1：利用冻融法脱细胞制备肌腱胶原；步骤S2:将步骤S1中所得的肌腱胶原浸泡在磷酸钙纳米簇中水浴矿化形成矿化的肌腱胶原优选地，上述方法中，所述步骤S2的环境温度为20℃-45℃，更优选为37℃。优选地，上述方法中，磷酸钙纳米簇的浓度为1.55mg/ml～1.70mg/ml。优选地，上述方法中，肌腱胶原与磷酸钙纳米簇的体积比为1：20～1：200。本专利技术制备得到的矿化肌腱胶原，是在提取的肌腱组织上直接进行组织原位矿化，节省了大量时间，并能在修复肌腱-骨连接处(如同种异体移植)的过程中能尽可能降低瘢痕组织的产生，从而达到肌腱-骨连接处仿生修复、减少并发症的作用。本专利技术制备的矿化肌腱胶原利用纳米簇渗透作用构建仿生梯度矿化结构，构建高仿生肌腱-骨移行的复合组织装配，促进肌腱-骨组织缺损修复。本专利技术的有益效果为：本专利技术制备得到的矿化肌腱胶原，具有良好的生物相容性和成骨诱导性等，将其用于制备修复肌腱-骨连接处的药物中的应用，具有很大的市场前景。附图说明图1：磷酸纳米簇矿化七天的矿化肌腱胶原的电镜图；图中标尺：0.2μm；图2：磷酸纳米簇矿化胶原促进肌腱骨连接处细胞分化；图3碱性磷酸酶染色定量分析；图4骨诱导活性试验中，空白对照组、对照组和实验组小鼠的micro-CT检测结果；具体实施方式实施例1矿化肌腱胶原的制备方法，包括如下步骤：步骤S1:肌腱胶原的制备：(1)冷冻肌腱放入液氮中2min；(2)在37℃的生理盐水中浸泡解冻10min；(3)吸干表面的多余水滴；反复重复上述操作5-10遍；步骤S2:磷酸钙纳米簇的制备：(1)分别配制0.1mol/L的氯化钙溶液、0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液、0.3g/mL的聚天冬氨酸溶液以及0.3g/mL的聚丙烯酸溶液；所用的聚丙烯酸的相对分子质量为450kDa，聚天冬氨酸的相对分子质量为7kDa。(2)取2mL氯化钙溶液与0.2mL聚天冬氨酸溶液混合均匀，作为溶液A。(3)取2mL磷酸氢二钠溶液与0.4mL聚丙烯酸溶液混合均匀，作为溶液B。(4)将溶液B逐滴缓慢加入到溶液A中形成混合溶液，并用氢氧化钠溶液将混合溶液的pH调节至中性，得到磷酸钙纳米簇。步骤S3:矿化肌腱胶原的制备：肌腱胶原浸泡在磷酸钙纳米簇溶液中，体积比为1：20；在37℃水浴包含5％二氧化碳的加湿空气中放置7天。图1为矿化七天的矿化肌腱胶原的电镜图实施例2(1)将磷酸钙纳米簇矿化的小鼠肌腱胶原(制备方法同实施例1，冷冻肌腱为冷冻小鼠肌腱)铺到24孔板底部作为实验组，商业化20～200nm羟基磷灰石矿化的小鼠肌腱胶原(制备方法同实施例1，冷冻肌腱为冷冻小鼠肌腱，用羟基磷灰石替代实施例1中的磷酸钙)铺到24孔板作为对照组，未矿化的小鼠肌腱胶原(即实施例1的步骤S1制备的小鼠肌腱胶原)铺到24孔板作为空白对照组。将实验组和对照组分别在风干和紫外灯照射杀菌之后，加入成骨分化诱导液，成骨分化诱导液的成分为包含10-8M地塞米松、50μg/mL抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸和10％小牛血清的培养基。(2)以104个细胞/孔的密度将人的骨-肌腱连接处细胞种于24孔板中，培养板放置于37℃包含5％二氧化碳的加湿空气中培养，DMEM(低糖)培养基每隔一天换一次。培养两个星期以后，观察细胞的生长和分化情况，对细胞进行ALP染色，发现实验组组染色明显深于对照组及空白对照组结果，如图2所示。图2A为对实验组培养14天以后的细胞染色图，图2B为对照组培养14天以后的细胞染色图，图3为空白对照组培养14天以后的细胞染色图。图3为对ALP染色阳性细胞进行计数，同样发现实验组纳米簇矿化肌腱胶原处理组阳性细胞数明显高于其他组。可以看出，实验组的细胞数明显多于对照组的细胞数，表明实施例1中磷酸钙纳米簇矿化的肌腱胶原可以促进人的骨-肌腱连接处细胞的分化。实施例3骨诱导活性实验实验：以C57小鼠(浙江大学动物实验中心)为体内实验对象。选取15只小鼠进行实验，随机分为实验组,对照组，空白对照组，每组各5只小鼠，其中实验组使用纳米簇矿化小鼠肌腱胶原(制备方法同实施例1，冷冻肌腱为冷冻小鼠肌腱)，对照组使用商业化20～200nm羟基磷灰石矿化的小鼠肌腱胶原(制备方法同实施例1，冷冻肌腱为冷冻小鼠肌腱，用羟基磷灰石替代实施例1中的磷酸钙)，空白对照组不使用任何材料。用0.3％戊巴比妥钠麻醉，剔除小鼠下肢皮毛，于小鼠膝关节外缘做平行切口，暴露股骨髁；使用骨科电钻(钻头直径0.8mm)钻通骨隧道，在骨髓道中植入矿化肌腱胶原。按动物伦理要求处死动物后micro-CT检测骨体积分数BV/TV。从图4的m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.矿化肌腱胶原在制备修复骨-肌腱连接处的药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.矿化肌腱胶原在制备修复骨-肌腱连接处的药物中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述矿化肌腱胶原是肌腱胶原浸泡在磷酸钙纳米簇中水浴加热矿化形成矿化肌腱胶原；更优选地，所述的矿化肌腱胶原由包括以下步骤的方法制备得到：步骤S1：利用冻融法脱细胞制备肌腱胶原；步骤S2:将步骤S1中所得的肌腱胶原浸泡在磷酸钙纳米簇中水浴矿化形成矿化肌腱胶原。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肌腱胶原与磷酸钙纳米簇的体积比为1：20～1：200。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的骨-肌腱连接处,包括肩袖腱骨连接处或跟腱腱骨连接处。


5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的骨-肌腱连接处，包括软骨连接，即透明软骨...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓，唐睿康，潘海华，茵梓，陈扬武，陈小怡，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33