一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法技术

一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，涉及病毒检测技术领域，包括步骤一：用传统PCR检测确定阳性样本，并以此作为LAMP检测方法的对照；步骤二：利用LAMP引物设计软件设计出多组流感H3N2的LAMP引物组；步骤三：样本逆转录，将样本从RNA样本逆转录成cDNA样本；步骤四：用多组流感H3N2的LAMP引物组对样本进行LAMP试验；步骤五：对步骤四中的产物进行电泳检测；步骤六：根据步骤五中的电泳检测实验结果，筛选出有效的LAMP引物组，本发明专利技术通过流感病毒H3N2的相关序列获得流感病毒H3N2典型的LAMP扩增电泳条纹图案，为后续的流感病毒H3N2的检测方法选出合适的引物组。

【技术实现步骤摘要】
一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法
本专利技术涉及病毒检测
，具体涉及到一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法。
技术介绍
流感病毒(InfluenzaVirus)是一种可感染人类和动物的单股负链RNA病毒，根据病毒核蛋白和基质蛋白的抗原性不同，流感病毒共分4个型，甲、乙、丙、丁型流感病毒。乙、丙和丁型流感病毒的抗原很稳定，较少发生变异，但甲型流感病毒上的表面抗原血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)很容易变异，产生许多亚型。目前已知的HA有18种亚型(H1-H18)，NA有11个亚型(N1-N11)，HA与NA的随意组合可形成多种亚型。由于该病毒抗原变异性强、传播迅速，多次引起世界大流行，严重危害人类生命安全。来自中国疾控中心的检测数据显示，2018年我国整体的流感流行水平明显高于往年，占门急诊病例总数的6％，患者人数比往年增加了1倍。这次流感流行主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亚型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。本区流感病原监测数据显示：2014-2018年，共釆集流感样病例的样品5280份，经检测769份为流感病毒阳性，阳性率14.56％，其中流感H3N2阳性406份，占52.8％，为本区流感的主要病原体。目前流感病毒的诊断方法主要有病毒分离培养法、血清学检测法以及分子生物学检测方法等。随着分子生物学的发展，由于其简便、易操作、更精确、更快速等特点填补了早期的病毒培养以及血清学的空白。目前，基因诊断技术发展迅速，应用也越来越广泛。因此，在流感防控工作中，开发更快速、准确、便捷的基因诊断技术以检测流感病毒H3N2，对预防其大流行，保障人类健康意义重大。流感的确诊需要依靠PCR的方法检测病毒核酸，但由于基层医院设备及技术的限制，PCR法操作较为复杂，需要专业PCR仪器，且耗时较长，难以推广。又由于PCR方法的高敏感性和特异性，在提取、扩增核酸过程中，核酸产物易污染实验室中的试剂、仪器设备和通风系统，从而造成实验室污染，出现假阳性结果。环介导等温基因扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，是由Notomi等在2000年专利技术的基因扩增方法，该法检测耗时短、灵敏度高、成本低廉，而且在整个反应过程及后续的结果观察中不需要特殊的仪器设备，适用于基层早期对流感病毒的检测和诊断。是一种简单快速的核酸扩增技术。MASAKI等利用LAMP技术对H5N1高致病性禽流感病毒实现快速诊断，其敏感度和检岀率均优于传统RT-PCR检测方法，可知LAMP比PCR更快速，灵敏，有着更为广泛的发展前景。因此，为快速、灵敏、准确监测流感H3N2病原，提升传染病防控能力，本专利技术基于H3N2流感病毒HA基因片段，利用软件设计出LAMP反应的引物组，开发H3N2流感病毒的LAMP引物组筛选方法。
技术实现思路
针对现有技术所存在的不足，本专利技术目的在于提出一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，具体方案如下：一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，包括如下步骤：步骤一：用传统PCR检测确定阳性样本，并以此作为LAMP检测方法的对照；步骤二：利用LAMP引物设计软件设计出多组流感H3N2的LAMP引物组；步骤三：样本逆转录，将样本从RNA样本逆转录成cDNA样本；步骤四：用多组流感H3N2的LAMP引物组对样本进行LAMP试验；步骤五：对步骤四中的产物进行电泳检测；步骤六：根据步骤五中的电泳检测实验结果，筛选出有效的LAMP引物组。进一步的，所述LAMP引物组包括内引物、外引物以及环引物。进一步的，所述步骤四具体为，制备反应体系，每个样本使用各引物组中的3种引物共6条，每个反应管分别加入5ul样本以及阳性对照样本、阴性对照样本置于不同的反应管中，再将反应管置于LAMP扩增仪中，在65℃条件下进行反应60min，反应结束后拍照记录图像。进一步的，所述步骤五具体为，使用1.5％的琼脂糖凝胶对LAMP扩增仪扩增的产物进行电泳检测，实验条件为120V，35min，之后在凝胶成像仪中照射紫外拍照。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：本专利技术基于流感病毒H3N2的相关序列，筛选出有效引物组，获得流感病毒H3N2典型的LAMP扩增电泳条纹图案，为后续的流感病毒H3N2的检测方法选出合适的引物组。附图说明图1为RT-LAMP法检测流感H3N2的样本在紫外光下的荧光检测效果图；图2为RT-LAMP法检测流感H3N2样品的LAMP实验电泳结果图(第一阶段)；图3为LAMP法检测流感H3N2样品的LAMP实验电泳结果图一(第二阶段)；图4为LAMP法检测流感H3N2样品的LAMP实验电泳结果图二(第二阶段)；图5-6为流感H3N2的引物组信息图；图7为流感H3N2样品的LAMP实验电泳结果图(优化后)。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步的详细说明，但本专利技术的实施方式不仅限于此。实施例实验仪器和设备LAMP引物设计与评估根据流感病毒H3N2相关序列，每个病毒基因的引物设计为5组，每组引物包含5对，进行相关评估后合成用于检测实验。第一轮筛选出引物中的主要引物对，筛选3个样品，同时结合PCR扩增测序结果，每种病毒筛选出2-3组有效引物。在前述实验的基础进行第二轮引物筛选，所选岀的2-3组引物中，加入次要引物对2对，再次进行筛选，以3-4个样品都对结果进一步验证。一、LAMP法检测第一阶段(RNA样本)：(1)样品信息：2017年11月收集的流感病毒H3N2样本22个，编号为1-22。经PCR实验确定为阳性的样本。(2)LAMP检测步骤反应体系：按下表配置RT-LAMP反应体系。每个样本使用3种引物，同时准备阳性对照以及阴性对照。反应体系中加入5ul样本、阳性对照(试剂盒内含)、阴性对照(ddH20)。设定65℃恒温水浴45min，之后，取出反应管在白光或紫外线下观察。之后，配置1.5％的琼脂糖凝胶，电泳检测样本扩增结果。二、LAMP法检测第二阶段：方法的改进及引物的筛选(cDNA样本)根据第一阶段实验实际操作遇到的问题调整方案，以优先筛选出特异性引物组为目的。考虑到病毒RNA降解快，调整为先逆转录为cDNA样本后再进行LAMP检测，筛选引物组。检测方法改为仅进行电泳检测，不添加荧光检测试剂。同时根据引物浓度对反应体系进行调整。(1)样本逆转录(2)LAMP法引物筛选与检测反应体系:按下表配置LAMP反应体系。每个样本使用3种引物，同时准备阳性以及阴性对照。反应体系中加入cDNA样本、阳性对照(试剂盒内含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一：用传统PCR检测确定阳性样本，并以此作为LAMP检测方法的对照；/n步骤二：利用LAMP引物设计软件设计出多组流感H3N2的LAMP引物组；/n步骤三：样本逆转录，将样本从RNA样本逆转录成cDNA样本；/n步骤四：用多组流感H3N2的LAMP引物组对样本进行LAMP试验；/n步骤五：对步骤四中的产物进行电泳检测；/n步骤六：根据步骤五中的电泳检测实验结果，筛选出有效的LAMP引物组。/n

【技术特征摘要】
1.一种流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：用传统PCR检测确定阳性样本，并以此作为LAMP检测方法的对照；
步骤二：利用LAMP引物设计软件设计出多组流感H3N2的LAMP引物组；
步骤三：样本逆转录，将样本从RNA样本逆转录成cDNA样本；
步骤四：用多组流感H3N2的LAMP引物组对样本进行LAMP试验；
步骤五：对步骤四中的产物进行电泳检测；
步骤六：根据步骤五中的电泳检测实验结果，筛选出有效的LAMP引物组。


2.根据权利要求1所述的流感H3N2的LAMP引物组筛选方法，其特征在于，所述LAMP引物组...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱晓华，廖夏，陈道湧，赵戴君，于晓南，杨吉星，张静，刘恬恬，
申请(专利权)人：上海市虹口区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：上海;31