本发明专利技术涉及辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物，包括两条长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2，以及一条长21bp的反向引物KS23C。本发明专利技术的关键创新点是发掘了与辣椒CMS育性恢复相关的SNP，开发出一个可用于辣椒CMS恢复系筛选的KASP分子标记KS23。利用KS23筛选辣椒CMS恢复系，只需根据实例三中的扩增体系和扩增程序，对待测植株DNA只进行一次PCR扩增，操作简单，无需进行CAPS标记的酶切反应和InDel标记复杂耗时的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接通过荧光定量PCR仪中荧光检测到的基因分型值和分布图，直接筛选出恢复基因型G/G和恢复系，检测效率达69％以上。
【技术实现步骤摘要】
辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用
本专利技术属于植物生物工程
，具体涉及辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用。
技术介绍
辣椒是重要的蔬菜作物，辣椒杂种优势明显，但辣椒杂交种子生产过程中需要人工去雄，费时费工，且纯度难以保证。利用雄性不育系，尤其是胞质雄性不育(CMS)“三系”配套法生产杂交种子，一方面不但可以省去人工去雄环节，省时省工，还能确保杂交种子纯度，另一方面还可以减少亲本流失风险，保护品种知识产权。然而，由于CMS恢复系较少，大多数自交系不具有恢复能力，需要人工田间转育恢复系。常规的转育方法是利用转育父本与恢复源进行不断的回交，每回交一代需要与不育系测交一代进行恢复单株的鉴定，费时费工，成本高，周期长。而利用分子标记可以对恢复单株进行苗期筛选，则无需进行单株测交验证，能够高效、快速地筛选恢复株系，极大缩短转育周期。现有技术存在的问题：目前，已有个别关于辣椒CMS育性恢复的分子标记，但这些标记存在的主要问题是通用性较差，对于不同遗传背景材料的选择效率较低。另一个主要问题是多少标记为CAPS标记，需要先进行PCR扩增，然后再进行酶切处理，最后再进行电泳检测，步骤较多，程序繁琐，且所需内切酶成本较高，导致检测成本上升。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术提供了辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：1、辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物KS23，包括两条长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2，以及一条长21bp的反向引物KS23C。KS23A1如序列表SEQIDNO：1所示，KS23A2如序列表SEQIDNO：2所示，KS23C如序列表SEQIDNO：3所示。2、辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物KS23获取方法，包括如下步骤：(1)利用不育系8A与恢复系R1(8A和R1均由甘肃省农业科学院蔬菜研究所选育)杂交，获得杂种一代F1，F1代植株自交得F2。(2)对F2群体进行育性鉴定，最后选取30株完全不育单株和30株完全可育单株，分别构建不育池SP和恢复池RP。(3)分别提取不育池SP和恢复池RP花蕾RNA，委托百迈克生物科技公司(http://www.biomarker.com.cn/)利用IlluminaHiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125。(4)利用转录组数据在线比对软件STAR分别对SP和RP测序reads与辣椒参考基因组(ThePepperGenomeDatabase2.0)进行比对，并通过GATK(版本：3.1-1，https://www.broadinstitute.org/gatk/index.php)，查找单SNP位点。(5)采用SNP-index法对不育池SP和恢复池RP进行SNP关联分析。SNP-index是通过混合池间的基因型频率差异进行标记关联分析的方法，SNP-index参数是指某个位点含有SNP的reads数与测到该位点的总reads数的比值，其数值从0到1不等。若该参数为0，代表所测到的reads都来自其中的一个亲本；该参数为1，代表所有reads都来自另一个亲本；该参数接近0.5，则代表此混池中SNP来自两个亲本的频率相同。将两个池观测到的SNP都计算出SNP-index，然后将两个池的SNP-index值相减后得到Δ(SNP-index)，将Δ(SNP-index)对应该SNP所在染色体位置作图，最后将辣椒CMS恢复性定位到染色体6末端一端长16.8M的区间(Chr06:199389022-216191732)。(6)寻找该区间在SP与RP之间存在的差异SNP，并提取包含相应SNP、以及上下游序列各100bp共201bp的基因组序列，利用在线软件BatchPrimer3V1.0(https://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)设计KASP标记引物，最终对42个差异SNP成功设计KASP标记引物。(7)对42对KASP标记引物在亲本间进行扩增检测，共检测到6对引物在亲本间存在差异SNP。以KASP标记KS23在亲本间的扩增为例，如附图1所示：恢复系父本R1的四次重复检测结果靠近X轴，并聚集为I类，基因型为G/G；不育系母本8A的四次重复检测结果靠近Y轴，并聚集为II类，基因型为A/A。(8)利用在亲本间有多态性的6对KASP标记在F2群体中进行多态性验证，发现KS23能将F2群体各单株聚为三类，如附图2所示：靠近X轴的样本聚集为I类，为纯合可育基因型G/G；靠近Y轴的样本聚集为II类，为纯合不育基因型A/A；靠近X、Y对称轴位置的样本聚集为III类，为杂合可育基因型A/G。KS23在F2群体中的基因型检测结果与育性表型鉴定结果一致性较高，达82％。因此，KASP标记KS23可作为鉴定辣椒CMS恢复系的候选分子标记。3、辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物的应用，包括如下步骤：(1)选取96个农艺性状优良的辣椒高代自交系材料，在每个自交系中选取1个单株，利用基因组DNA提取试剂盒或CTAB法提取每个单株基因组DNA备用。(2)同时，以CMS不育系8A为母本，分别以选取的96个辣椒自交系单株为父本，在花期进行测交试验，待杂交果实老熟后分别收获96份杂交组合种子。(3)利用实施例2中的KS23标记引物对步骤(1)中提取的96份DNA样品进行扩增与荧光检测。PCR扩增体系为10μL,包括5μL1030ngμL-1的DNA检测模板，0.14μLprimermixture，2μL的2×KASPMasterMix(LGCGenomics,Shanghai,China)。(4)PCR反应程序为:30℃读数60秒；94℃变性15分钟；94℃变性20秒，61℃-55℃(每个循环下降0.6℃)退火60秒，10个循环；94℃变性20秒，55℃退火60秒，26个循环；94℃变性20秒，57℃退火60秒，8个循环；30℃读数60秒。(5)荧光参数设置时，Allele1碱基设定为G，荧光Reporter设定为FAM；Allele2碱基设定为A，荧光Reporter设定为VIC。(6)运行程序，反应结束后后统计每个单株检测到的碱基类型(G或A),G/G为纯合恢复型，A/A为纯合不育保持型，G/A为杂合部分恢复型。(7)种植步骤(2)中收获的96份杂交种子，开花结果期调查并统计每个测交组合的育性情况，不育或者可育(育性恢复)。(8)通过比较步骤(6)中统计到的基因型与步骤(7)中统计的表型，一致性达69％，达到了分子标记筛选的目的。有益效果：本专利技术的关键创新点是发掘了与辣椒CMS育性恢复相关的SNP，开发出一个可用于辣椒CMS恢复系筛选的KASP分子标记KS23。KS23包含2条分别长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2、以及一条长21bp的反向引物KS23C。利用KS23筛选辣椒CMS恢复系，只需根据实例三中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物，其特征在于，所述KS23A1如序列表SEQ ID NO：1所示，所述KS23A2如序列表SEQ ID NO：2所示，所述KS23C如序列表SEQ ID NO：3所示。/n
【技术特征摘要】
1.辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物，其特征在于，所述KS23A1如序列表SEQIDNO：1所示，所述KS23A2如序列表SEQIDNO：2所示，所述KS23C如序列表SEQIDNO：3所示。
2.如权利要求1所述辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物的获取方法，包括如下步骤：
(1)利用不育系8A与恢复系R1杂交，获得杂种一代F1，F1代植株自交得F2；
(2)对F2群体进行育性鉴定，最后选取30株完全不育单株和30株完全可育单株，分别构建不育池SP和恢复池RP；
(3)分别提取不育池SP和恢复池RP花蕾RNA，利用IlluminaHiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125；
(4)利用转录组数据在线比对软件STAR分别对SP和RP测序reads与辣椒参考基因组进行比对，并通过GATK，查找单SNP位点；
(5)采用SNP-index法对不育池SP和恢复池RP进行SNP关联分析；
(6)寻找该区间在SP与RP之间存在的差异SNP，并提取包含相应SNP、以及上下游序列各100bp共201bp的基因组序列，利用在线软件BatchPrimer3V1.0设计KASP标记引物，最终对42个差异SNP成功设计KASP标记引物；
(7)对42对KASP标记引物在亲本间进行扩增检测，共检测到6对引物在亲本间存在差异SNP；
(8)利用在亲本间有多态性的6对KASP标记在F2群体中进行多态性验证，确定KASP标记KS23可作为鉴定辣椒CMS恢复系的候选分子标记。
3.权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏兵强，王永富，张高原，叶德友，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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