MALDI-TOFMS微生物鉴定样本生物安全前处理方法技术

本发明专利技术涉及MALDI

【技术实现步骤摘要】
MALDI
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TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法


[0001]本专利技术涉及MALDI
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TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法，属于生物医药类微生物检测样品提取装置领域。

技术介绍

[0002]病原体的快速、准确识别是临床感染诊断、传染病预防控制、食品安全等公共卫生问题的关键因素。随着软电离技术的发展，基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI
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TOF MS）的微生物识别技术也随之问世，该技术是在完整的微生物中添加酸性基质辅助细胞裂解，激光激发细胞裂解物（小蛋白或多肽）形成肽质量指纹谱，与已构建的属、种水平的共性参考谱库进行比对分析，从而实现微生物的鉴定。目前该技术体系已经成熟，其快速、自动化高通量、准确的特性已使其在全球临床诊断、质检、传染病监测、食品安全等领域占有一席之地，并迅速发展。商业化的质谱微生物鉴定系统继布鲁克及岛津公司之后，国内质谱研发及生产厂家正蓬勃发展。为提高公共卫生病原检测能力，我国各级疾控系统均在配备质谱微生物鉴定系统，以提高未知病原快速鉴定能力。微生物鉴定用质谱使用主要包括四个流程：样本制备、点靶、上机检测、数据库检索鉴定。样本制备的优劣直接影响谱图的质量及鉴定成功率。
[0003]目前，微生物质谱鉴定样本制备的方法主要有直接涂抹法、扩展直接涂抹法、提取法、以及本专利技术人前期开发的沉淀涂抹法。（1）直接涂抹法，是将待检测的菌株样本直接涂抹到样本靶上，点上基质溶液后即可上机，该方法快速但鉴定效率低（是提取法的50%
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75%），因只靠基质溶液覆盖，存在覆盖不完全的问题，导致病原容易暴露，无法杀死绝大多数病原，具有巨大的生物安全隐患。（2）扩展的直接涂抹法，是在覆盖基质前，先覆盖70%的甲酸溶液，用于辅助细胞破壁裂解，增加鉴定成功率，与直接涂抹法比较鉴定能力略有提高，但溶液成分不能完全杀死病原体，尤其是厚壁、荚膜及芽孢菌，生物安全隐患无法解决。（3）提取法是利用提取液提取病原菌蛋白，鉴定能力非常好，生物安全性也高于涂抹法，但对于厚壁、芽孢等微生物，提取法仍然无法杀灭病原，具有生物安全隐患，极易造成过严重的生物安全事故。（4）沉淀涂抹法更适用于微量病原的质谱鉴定，谱图质量与提取法相当，但生物安全性低于提取法。
[0004]目前全球范围内没有用于质谱微生物检测样本生物安全提取的商业化产品。现有技术报道的适用于MALDI
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TOF MS方法的待测样本制备过程中，存在生物安全风险，这是由于待鉴定的微生物都是未知微生物，操作者不能根据菌株的外观形态判断该微生物是否是高致病性的，也不能提前预知待测微生物是否带有荚膜或芽孢，只能统一按照一个生物安全等级进行样本前处理，对于厚壁、芽孢等微生物，目前的提取装置无法简便快速杀灭或隔离病原，具有生物安全隐患。假如已知待检测微生物是带有芽孢或荚膜的病原微生物，在提取样品后还需要对可能存在的芽孢或菌体做过滤处理，而能完成过滤芽孢或菌体的装置只有超滤管或滤器。常用的超滤管是密理博公司的产品，价格贵，每个在30元以上，并且该超滤管所需要的样本体积至少要50
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100微升，且需要是菌浓度高于108CFU/ml的菌液，对于常
规培养出来的单菌落因获得的滤液中蛋白成分达不到质谱的检测限而无法进行鉴定（菌量不足的菌液样品）；而常规的滤器处理的样本体积更大，至少要200微升以上。因此浓度低、体积小的微量的菌液根本无法应用现有技术的方法制得适用于MALDI
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TOF MS方法的样本。
[0005]为适应和推广微生物质谱鉴定系统在全国范围内的广泛应用，本领域迫切需要一种简便、快速同时又具备生物安全性的处理微生物样品的方法和装置。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种具有生物安全性的、用于MALDI
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TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法。
[0007]本专利技术首先提供的一种具有操作简便、省时省力、具有生物安全性的样本制备床，包括管体，管盖和与管体底部连接的导流柱；所述管体的底部铺放滤膜或超滤膜，且管体底部设置有开口，所述开口连接导流柱；所述管盖通过连接部与管体连接，管盖、管体和连接部之间一体成型；所述管盖的底部封口，具有非镂空的管底平面，盖上管盖后，管盖底部平面能够与管体底部的滤膜或超滤膜相接触。
[0008]本专利技术中，设置管盖盖上后，管盖底部能够与滤膜或超滤膜相接触，是考虑到管盖盖上的过程中，依靠管盖的压力推进，使管体内的空气产生正向压力，使得加入管体的样本液体流过滤膜并截留细菌菌体或截留细胞，或截留蛋白。
[0009]每个样本制备床只放置一张滤膜。一个样本想要截留不同尺寸的物质，使用不同滤膜孔径的样品制备床。
[0010]本专利技术中，所述滤膜为膜孔径范围为0.01
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0.2μm的滤膜，或孔径范围为5μm的滤膜，或孔径范围为0.002
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0.01μm的滤膜。
[0011]本领域技术人员应当理解，用于微生物鉴定用的率膜孔径范围为至0.01到0.2μm，用于血细胞截留滤膜孔径范围为5μm，用于蛋白截留滤膜孔径范围为0.002到0.01μm。
[0012]本专利技术提供的样本制备床中，所述管体自上而下内径均匀一致；所述管盖其嵌入管体的部分自上而下外径均匀一致。
[0013]优选地，管体内径与管盖嵌入管体部分的外径之差d为≥0.0001μm。
[0014]进一步优选地，所述管盖底部周围箍套垫圈，起到密封作用。
[0015]为增加管盖与垫圈的嵌合力度，本专利技术在管盖底部外径内缩，使管盖嵌入管体部分的纵切面呈现倒“凸”字型，内缩部分的管盖底部周围箍套弹性垫圈，如橡皮质地的垫圈，以增加管盖与管体的密封性。
[0016]更优选地，为增加管盖与垫圈的嵌合力度，防止垫圈脱落，本专利技术在管盖嵌入管体部分上，距离管盖底部0.1
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2 mm距离设置一内陷凹槽，凹槽内箍套弹性垫圈。
[0017]本专利技术还提供一种样本制备装置，包括上述的样本制备床和助力架，所述助力架由底座，样本管架，样本制备床架组成；底座上可拆卸地固定样本管架，样本制备床架可拆卸地固定在样本管架上。即底座上自下而上依次可拆卸地固定样本管架、样本制备床架。
[0018]所述样本管架能够放置一个或多个样本管，所述样本制备床架能够放置一个或多个样本制备床；
所述样本制备床架上的样本制备床的导流柱与所述样本管架上的样本管口对应，使样本管能够接收样本制备床导流柱内流出的液体样本。
[0019]进一步优选地，本专利技术的样本制备装置，还包括压力盖，所述压力盖与底座一侧边缘通过转轴连接，按压压力盖，下压样本制备床架上放置的样本制备床的管盖，使样本管架上的样本管收集到样本制备床导流柱的流出液。
[0020]本专利技术提供了上述样本制备床或样本制备装置在以下任一种应用：（1）在制备具有生物安全的待检测样本中的应用；（2）在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种样本制备床，其特征在于，包括管体，管盖和与管体底部连接的导流柱；所述管体的底部铺放滤膜或超滤膜，且管体底部设置有开口，所述开口连接导流柱；所述管盖通过连接部与管体连接，管盖、管体和连接部之间一体成型；所述管盖的底部封口，具有非镂空的管底平面，盖上管盖后，管盖底部平面能够与管体底部的滤膜或超滤膜相接触。2.根据权利要求1所述的样本制备床，其特征在于，所述滤膜为膜孔径范围为0.01
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0.2μm的滤膜，或孔径范围为5μm的滤膜，或孔径范围为0.002
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0.01μm的滤膜。3.根据权利要求1或2所述的样本制备床，其特征在于，（1）所述管体自上而下内径均匀一致；所述管盖其嵌入管体的部分自上而下外径均匀一致；管体内径与管盖嵌入管体部分的外径之差d≥0.0001μm；管盖底部周围箍套垫圈；或（2）管盖底部外径内缩，使管盖嵌入管体部分的纵切面呈现倒“凸”字型，内缩部分的管盖底部周围箍套弹性垫圈；或（3）管盖嵌入管体的部分上，在距离管盖底部0.1
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2 mm距离的设置一内陷凹槽，凹槽内箍套弹性垫圈。4.一种样本制备装置，其特征在于，含有权利要求1
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3任一所述的样本制备床和助力架，所述助力架由底座，样本管架，样本制备床架组成；底座上可拆卸地固定样本管架，样本制备床架可拆卸地固定在样本管架上；所述样本管架能够放置一个或多个样本管，所述样本制备床架能够放置一个或多个样本制备床；所述样本制备床架上的样本制备床的导流柱与所述样本管架上的样本管口对应，使样本管能够接收样本制备床导流柱内流出的液体样本。5.根据权利要求4所述的样本制备装置，其特征在于，还包括压力盖，所述压力盖与底座一侧边缘通过转轴连接，按压压力盖，下压样本制备床架...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖迪，李园园，张炳华，
申请(专利权)人：北京拓谱科技有限公司，
类型：发明
国别省市：