一种犬腺病毒一体化核酸检测卡盒制造技术

本发明专利技术公开了一种犬腺病毒一体化核酸检测卡盒，包括顶部带盒盖的盒体，盒体内从上至下依次设有裂解腔、第一清洗腔和第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液，所述反应腔中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有犬腺病毒Ⅰ型hexon基因和犬腺病毒Ⅱ型hexon基因的引物探针混合液。本发明专利技术可以在相对较低成本的情况下，快速一体化地对犬腺病毒进行PCR扩增及检测，解决现行技术重复性差、检测方法耗时、操作复杂等问题。问题。问题。

【技术实现步骤摘要】
一种犬腺病毒一体化核酸检测卡盒


[0001]本专利技术涉及一种犬腺病毒一体化核酸检测卡盒，属于医学检测


技术介绍

[0002]犬腺病毒是已知哺乳动物腺病毒属中致病性最强、形态结构也研究的较为彻底的一种动物病毒。犬腺病毒(canine adenovirus，CAV) 有两个血清型：CAV
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1型和CAV
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2型。CAV
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1是传染性犬肝炎的病原体，此病是犬科动物疾病中与犬瘟热及病毒性肠炎相并列的3种主要传染病之一。犬腺病毒Ⅱ型(Canine adenovirus type 2，CAV
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2) 是与传染性气管支气管炎(canine infectious tracheobronchitis， ITB)的发病机理有关的病因之一，可引起犬轻度急性上呼吸道疾病。犬传染性支气管炎是一种呼吸道传染病，具有很强的传染性，呈群发态势，对犬危害很大。
[0003]犬腺病毒同其它腺病毒一样，其基因组为线状、双股DNA。其纤突直径为2nm，长度随腺病毒型而不同，CAV
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2的纤突为35～37nm，比CAV
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1的纤突长10nm左右。纤突的远端部分为腺病毒型特异性抗原，纤突的基部为亚群特异性抗原。纤突顶端为一个4nm直径的球形物(又叫knob)，这是病毒感染细胞时结合于细胞受体的部分，血凝素也在球部，两型犬腺病毒在血凝方面的差别和纤突结构有关，在和红细胞发生凝集时，两者可能使用不同的或不完全相同的RBC表面受体。纤突的氨基酸保守区为底部(又叫tail)，与五邻粒基底相连，远离壳粒的一端为C末端，中间部分是由脯氨酸和疏水氨基酸残基组成(又叫shaft)，含有多个重复序列，但其氨基酸组成却不保守，这与腺病毒不同血清型的抗原特异性相关。纤突蛋白和某些非结构蛋白均系糖基化蛋白。另外纤突蛋白可阻断腺病毒大分子合成，抑制病毒繁殖。
[0004]近年来随着宠物市场的不断扩大以及实验动物学的发展和实验犬只的用量不断增加，犬与人类的接触更加密切和频繁，而由CAV
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1 型和CAV
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2型引起的病毒病症状及后续的治疗不同，因此鉴定两种型别犬腺病毒的诊断方法对犬类健康质量的控制显得尤为重要。
[0005]目前对犬腺病毒的检测方法主要有病毒分离法、抗体检测、核酸分子检测法。具体如下：
[0006](1)病毒的分离和鉴定：可采取发病初期的病犬血液、扁桃体棉拭子或死亡动物的肝、脾等材料处理后接种犬肾原代细胞或继代细胞，根据毒株和接毒剂量的不同，细胞病变最早出现于接毒后30小时，但有时需待一周才能见到。
[0007](2)抗体检测：病毒感染后会使体内出现特异性免疫反应，产生特异性的抗体，可通过酶联免疫(ELISA)或胶体金等方法检出。该方法设备简单，需要的试剂较少，操作简捷方便，可以在数小时内得到结果。但因IgM、IgG抗体产生的窗口期及交叉反应，所以此法适用于初步筛查。
[0008](3)核酸分子检测法：通过对病毒DNA的同源性比较，可在其基因序列的保守区(如六邻体蛋白基因)设计出能对所有腺病毒进行特异性扩增的引物，通过PCR扩增将腺病毒从
其它病毒中鉴别出来。
[0009]病毒分离法检测周期长，且要求的病毒培养实验室在普通的宠物检测单位极少配备。故目前腺病毒的检测主要集中在抗体和核酸检测。抗体检测操作便捷、检测迅速，可作为核酸诊断的补充手段，但由于抗体检测“假阳性”，“假阴性”和灵敏度等局限性，不适合用于病原的确诊，也不适用于在低流行地区的流行病学调查。核酸检测目前是腺病毒检测的“金标准”，具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点。
[0010]尽管近几年，市场上出现多家特异性荧光探针RT
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PCR法检测犬腺病毒核酸试剂盒，以检测待测样本中的犬腺病毒核酸，但这些试剂盒对于基层宠物检测实验室具有一些局限性：1)操作技能要求严格，需经专业培训，执PCR上岗证上岗，必须在PCR认证实验室开展；2) 特定的核酸提取方法和条件，易污染且延长操作时间，为此开发出一个省时省力的犬腺病毒全自动核酸提取扩增检测分型卡盒对基层宠物病原检测机构来说势在必行。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于，提供一种犬腺病毒一体化核酸检测卡盒。它可以在相对较低成本的情况下，快速一体化地对犬腺病毒进行PCR扩增、检测及类型鉴别，解决现行技术重复性差、检测方法耗时、操作复杂等问题。
[0012]本专利技术的技术方案：一种犬腺病毒一体化核酸检测卡盒，其特点是：包括顶部带盒盖的盒体，盒体内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔、带第一清洗液的第一清洗腔和带第二清洗液的第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液；所述反应腔中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有犬腺病毒Ⅰ型hexon基因和犬腺病毒Ⅱ型hexon基因；所述裂解腔内设有能穿过柱塞的柱塞孔的磁珠。通过推动柱塞，可以使柱塞孔对准两个相邻腔体的连通区间，此时两个腔体件依靠附着在柱塞孔内的疏水性液态封闭材料进行隔离，然后磁珠(利用外部磁钢拖动)便可穿过柱塞孔的疏水性液态封闭材料，从一个腔体转移到另一个腔体。扩增反应所需的引物探针混合液在可熔性材料内，使反应液体系的反应液与引物探针混合液分离，避免反应液中的酶将引物切割，保证卡盒的稳定性，延长卡盒的有效期。可熔性材料为石蜡、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃类物质中的任意一种或多种的组合，熔点范围为20℃
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95℃，优选石蜡，使用时熔化为液态的石蜡油可以防止形成气溶胶的PCR产物污染环间；石蜡油热传导性弱，有效保证PCR的温度条件；石蜡的低温凝固特性在磁珠回拖温度下降后可以固定磁珠位置。石蜡可熔性使包埋物可以使反应液从隔离状态合并。
[0013]上述的犬腺病毒一体化核酸检测卡盒中，所述所述扩增反应液内包含Taq DNA聚合酶或rTaq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶是嗜热菌株中提纯的天然酶，rTaq DNA聚合酶是从和大肠杆菌重组表达纯化的基因工程酶，且能够在卡盒使用时耐受盒内可熔性材料熔化时所需的高温(65度
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95度)，能够在2
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8度下长期保存。
[0014]前述的犬腺病毒一体化核酸检测卡盒中，所述犬腺病毒Ⅰ型 hexon基因和犬腺病毒Ⅱ型hexon基因的引物探针混合液包括：犬腺病毒Ⅰ型hexon基因上游引物和犬腺病毒Ⅰ型hexon基因下游引物，犬腺病毒Ⅱ型hexon基因上游引物和犬腺病毒Ⅱ型hexon基因下游引
物，内标上游引物和内标下游引物，以及犬腺病毒型Ⅰ型hexon基因探针、犬腺病毒型Ⅱ型hexon基因探针和内标探针，具体为
[0015][0016]前述的犬腺病毒一体化核酸检测卡盒中，所述裂解液包含1<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种犬腺病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于：包括顶部带盒盖(2)的盒体(1)，盒体(1)内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔(3)、带第一清洗液的第一清洗腔(4)和带第二清洗液的第二清洗腔(5)，其中裂解腔(3)连通至盒盖(2)，第二清洗腔(5)连通至盒体(1)外侧底部设置的反应腔(6)；所述裂解腔(3)、第一清洗腔(4)、第二清洗腔(5)和反应腔(6)的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞(7)，柱塞(7)的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔(6)内设有扩增反应液；所述反应腔(6)中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有犬腺病毒Ⅰ型hexon基因和犬腺病毒Ⅱ型hexon基因的引物探针混合液；所述裂解腔(3)内设有能穿过柱塞(7)的柱塞孔的磁珠(8)。2.根据权利要求1所述的犬腺病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于：所述扩增反应液内包含Taq DNA聚合酶或rTaq DNA聚合酶。3.根据权利要求1所述的犬腺病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于：所述犬腺病毒Ⅰ型hexon基因和犬腺病毒Ⅱ型hexon基因的引物探针混合液包括：犬腺病毒Ⅰ型hexon基因上游引物和犬腺病毒Ⅰ型hexon基因下游引物，犬腺病毒Ⅱ型hexon基因上游引物和犬腺病毒Ⅱ型hexon基因下游引物，内标上游引物和内标下游引物，以及犬腺病毒型Ⅰ型hexon基因探针、犬腺病毒型Ⅱ型hexon基因探针和内标探针，具体为具体为4.根据权利要求1所述的犬腺病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于：所述裂解液包含1
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1000mM乙酸
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乙酸钠，0.1
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵怀，赵志敬，华灿忠，卜柯丽，
申请(专利权)人：杭州遂曾生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：