一种荧光标记CRISPR/SpCas9系统介导的基因替换体系及其在植物中的应用技术方案

本发明专利技术公开了一种重组载体、DNA分子、应用及植物中以RNA转录本为模板进行目的基因同源重组的方法。该重组载体包括表达盒甲、表达盒乙和表达盒丙；表达盒甲包括启动子甲、SpCas9

【技术实现步骤摘要】
一种荧光标记CRISPR/SpCas9系统介导的基因替换体系及其在植物中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组载体、DNA分子、应用及植物中以RNA转录本为模板进行目的基因同源重组的方法。

技术介绍

[0002]CRISPR/SpCas9系统自2013年8月首次报道对植物基因组进行编辑以来，大量相关研究相继开展。这些研究分别以拟南芥、生烟、水稻和小麦等植物为供试材料，通过转基因技术将优化的SpCas9基因和gRNA转入植物体内，SpCas9蛋白通过自身的核酸内切酶活性，对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶点序列进行编辑，从而引起靶位点基因组DNA序列双链断裂(double
‑
strand breaks，DSBs)，然后通过非同源末端连接(non
‑
homologous end joining，NHEJ)或同源重组介导的修复(homology
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directed repair，HDR)两种方式引入突变，从而实现了植物基因组的定点编辑，证明该技术在植物生物学研究领域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，其特征在于：包括表达盒甲、表达盒乙和表达盒丙；所述表达盒甲包括启动子甲、SpCas9
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T2A
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GFP融合基因和终止子，所述SpCas9
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T2A
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GFP融合基因表达SpCas9、T2A和GFP，所述T2A是能发生自我切割的小肽；所述表达盒乙包括启动子乙和gRNA的编码基因，所述gRNA靶向的目标片段是植物基因组中将被替换的DNA片段；所述表达盒丙包括启动子丙、核酸酶甲的编码基因、模板区段、核酸酶乙的编码基因，所述模板区段包括所述目标片段的上游同源臂、供体片段和所述目标片段的下游同源臂；所述供体片段与所述目标片段具有如下差异：所述供体片段含有预期在所述目标片段中引入的差异核苷酸。2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述供体片段与所述目标片段具有如下至少一种差异：
②
所述目标片段含有所述gRNA的靶标片段，所述供体片段含有预期在所述靶标片段中引入的差异核苷酸；
③
所述目标片段中不包括限制性内切酶的识别序列，所述供体片段含有所述限制性内切酶的识别序列。3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于：所述SpCas9
‑
T2A
‑
GFP融合基因编码氨基酸序列如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏兰琴，李慧园，闫磊，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：