甜瓜瞬时表达系统的建立和应用技术方案

本发明专利技术涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种甜瓜瞬时表达系统的建立和应用。构建方法为：(1)黑暗环境中利用酶解液对甜瓜组织酶解；(2)利用第一终止液对酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，获得原生质体；(3)将原生质体冰浴后离心去除上清，使用重悬液重悬，获得纯化的原生质体；(4)继续和质粒DNA混合，加入PEG4000

【技术实现步骤摘要】
甜瓜瞬时表达系统的建立和应用


[0001]本专利技术属于细胞工程
，具体涉及一种甜瓜瞬时表达系统的建立和应用。

技术介绍

[0002]瞬时表达系统与稳定的遗传转化相比是一种快速有效的表达方法，其便捷的操作和高通量的转化可用于多种功能分析，例如基因表达分析、亚细胞定位、细胞内蛋白质转运分析、蛋白质相互作用以及启动子活性分析等。根癌农杆菌介导注射、生物弹轰击和PEG介导的原生质体转染是瞬时转化最常用的手段。与生物弹轰击和农杆菌侵染相比，PEG介导的原生质体转化更方便有效。原生质体是一种去除了细胞壁但保留完整的质膜和细胞器的细胞。原生质体为研究蛋白质功能提供了一个基于细胞的理想实验空间，DNA、RNA和蛋白质等大分子可以通过多种方式被传递到原生质体中。基于原生质体的瞬时转化已在许多植物中进行，例如拟南芥、水稻、玉米、草莓、黄瓜等。然而，有关甜瓜原生质体分离以及在甜瓜中建立瞬时转化系统的研究还未见报道。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的之一是在一定程度上解决上述问题。本专利技术针对现有技术存在的缺陷，提供了一种建立甜瓜瞬本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，所述甜瓜瞬时表达系统通过下述方法构建获得：(1)在黑暗环境中，利用酶解液对甜瓜组织进行酶解处理，所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、2
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吗啉代乙烷磺酸和甘露醇，以此获得酶解后溶液；(2)利用第一终止液对所述酶解后溶液进行终止处理，过滤，对滤液离心去上清，以便获得原生质体；(3)将所述原生质体冰浴后离心去除上清，使用重悬液重悬，以便获得纯化的原生质体；(4)将所述纯化的原生质体和质粒DNA混合，然后加入PEG4000
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Ca
2+
溶液，在黑暗环境下进行转染，以便获得转染产物；(5)在所述转染产物中加入第二终止液，对获得的终止产物进行离心，以便获得含有质粒DNA的原生质体；(6)将所述含有质粒DNA的原生质体在黑暗环境下孵育，离心去上清，以便建成所述甜瓜瞬时表达系统。2.根据权利要求1所述的甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，所述甜瓜组织为来自于甜瓜的第一片真叶和子叶；任选地，所述甜瓜组织通过下述方法获得：将甜瓜种子在黑暗中浸种处理，以便获得发芽的甜瓜种子；将所述发芽的甜瓜种子在空气相对湿度为40％～80％、光周期为12～20小时光和6～12小时暗的交替环境中培养，以便获得甜瓜植株，所述甜瓜组织来自于所述甜瓜植株。3.根据权利要求1所述的甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，所述酶解液包括1％～5％w/v纤维素酶、0.1％～1％w/v离析酶、10～50mM的2
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吗啉代乙烷磺酸和0.1M～2M的甘露醇；任选地，所述酶解液包括1.5％w/v纤维素酶、0.4％w/v离析酶、20mM的2
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吗啉代乙烷磺酸和0.4M甘露醇，所述酶解液的pH为5.8；任选地，步骤(1)中所述酶解时间为4～12小时，优选为4～8小时，更优选为6小时；任选地，所述质粒DNA中含有编码荧光蛋白的基因，优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。4.根据权利要求1所述的甜瓜瞬时表达系统，其特征在于，所述第一终止液和所述第二终止液各自独立地包括2
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吗啉代乙烷磺酸、钙盐、钠盐和钾盐；优选地，所述第一终止液和所述第二终止液各自独立地包括1～5mM MES，100～200mM NaCl，100～100mM CaCl2和3～10mM KCl；任选地，所述第一终止液和所述第二终止液各自独立地包括2mM MES，154mM NaCl，125mM CaCl2和5mM KCl，所述第一终止液和所述第二终止液的pH各自为5～6.5；任选地，步骤(3)中对所述原生质体冰浴时间为20～50分钟，优选为30分钟。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：许昕阳，沈佳，寿伟松，张跃建，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：