一种通过评估分析物的溶剂效应对亲和力实验的影响来指导SPR检测前处理的方法技术

本发明专利技术公开一种通过评估分析物的溶剂效应对亲和力实验的影响程度来指导SPR检测前处理的方法，是将分析物缓冲液先进行预实验，计算bulk/R0比值，如果bulk/R0低于一定标准，则不需要换液直接进行SPR检测，可继续后续实验；如果产生的bulk/R0高于一定标准，则先进行换液处理。本发明专利技术可以指导和优化现有实验流程，大大提高实验效率，减少成本损耗。减少成本损耗。减少成本损耗。

【技术实现步骤摘要】
一种通过评估分析物的溶剂效应对亲和力实验的影响来指导SPR检测前处理的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及一种通过评估分析物的溶剂效应对亲和力实验的影响程度来指导SPR检测前处理的方法。

技术介绍

[0002]表面等离子共振(SPR,Surface Plasmon Resonance)是一种光学物理传感技术。当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面时，引起金属自由电子共振，使电子吸收光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角成为SPR角。对于特定规格的仪器，表面等离子共振的发生角度只与芯片上方液体的折射率成正比，而折射率的变化在一定范围内与分子浓度成线性相关。利用SPR原理，当分析物流过芯片表面时，芯片表面与分析物结合量的变化会引起芯片上方分子浓度的变化，从而引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化。通过监测SPR的角度变化，获得待分析物的浓度、亲和力、动力学常数等信息。自1990年第一台基于SPR原理的BIACORE
TM
产品问世以来，其以其独特的视角揭示了蛋白质、核酸等多种生物分子之间的相互作用。由于无需标记、实时检测、样品量少、灵敏度高、方便快捷等优点，以Biacore为代表的SPR技术被广泛应用于基础科研、药物研发、生产质检等多个领域。凭借其卓越表现，Biacore检测被收录进美国、日本与2020版中国药典，全球超过80％的上市抗体药物采用其进行研发和申报。
[0003]为保证稳定性，市售蛋白中加入保护剂，是行业内常用的一种手段。添加的蛋白保护剂主要有糖类(海藻糖、蔗糖、甘露醇)，氨基酸类(组氨酸、精氨酸等)及其他(甘油等)。其中糖类是出现频次最多的，通过对商品化蛋白进行调查发现：海藻糖，甘露醇，蔗糖最常见的添加剂量为5％
‑
10％，其中海藻糖出现的频次最多。
[0004]基于SPR原理，芯片表面的折射率除与分子浓度和结合到芯片表面的分子质量相关外，还与流经芯片的溶剂种类相关。当分析物流过芯片表面时，会因为分析样品的溶剂和运行缓冲液之间折光率的差异产生信号差，称为溶剂效应。海藻糖，甘露醇，蔗糖，甘油等均是高折光率物质，能够产生非常高的溶剂效应。通常情况下，高折光物质含量越高产生溶剂效应也会越高，在结果分析时，溶剂效应产生的高背景信号在扣除时会对实验数据和图谱产生影响，为保证数据的准确性和可靠性，在实验中需要降低高折光物质含量以降低溶剂效应。因此当分析物中有高折光率物质时，常规手段是在实验前将分析物中的高折光物质用透析法或脱盐柱进行换液去除。换液操作将导致在时间上多花费1
‑
2天，且产生成本的额外消耗。
[0005]但换液存在以下问题：
①
蛋白损耗：换液回收率一般在50％
‑
90％，尤其当蛋白难以纯化、价格昂贵或可提供的样品量很少时，蛋白的损耗率就会成为一个很关键的因素；
②
可能对蛋白稳定性或活性产生影响，从而对实验结果的准确性产生影响；
③
耗材试剂成本和时间消耗：换液需要额外的人工操作及相关试剂耗材如脱盐柱、半透膜、缓冲液等。
[0006]鉴于以上问题，研究人员希望明确溶剂效应对实验数据影响程度，以省略不必要
的换液操作、减少换液频率，达到提高效率，减少损耗，减少实验不确定性因素的目的。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种通过评估分析物的溶剂效应对亲和力实验的影响程度来指导SPR检测前处理的方法，以明确哪些情况可以跳过换液步骤，从而节约成本，提高效率。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0009]一种通过评估分析物的溶剂效应对亲和力实验的影响程度来指导SPR检测前处理的方法，包括：
[0010]1)所述分析物取样，检测bulk和R0，其中，bulk是指所述分析物最高工作浓度结合阶段时在参比通道产生的信号，且bulk<3500RU，R0是指分析物最高工作浓度在结合阶段时配体通道扣减参比通道后结合信号值；计算bulk/R0比值；
[0011]2)对于高亲和力、中亲和力的反应，当bulk/R0≤10时，分析物无需换液，直接进行SPR检测；当10<bukl/R0<50时，根据对于图谱的要求，决定是否换液；当bulk/R0≥50时，需要先换液再进行SPR检测；
[0012]对于低亲和力的反应，当bulk/R0≤10时，分析物无需换液，直接进行SPR检测；当10<bukl/R0<20时，可根据对于图谱的要求，决定是否换液；当bulk/R0≥20时，需要先换液后再进行SPR检测；
[0013]其中，高亲和力是指分析物的相互作用对K
D
<1nM，中亲和力是指分析物的相互作用对1nM≤K
D
≤100nM，低亲和力是指分析物的相互作用对K
D
>100nM。
[0014]具体的，所述对于图谱的要求是指，在扣减后的图谱中，在结合阶段开始前和结束后是否出现凸起和下凹的小峰；如果不消除图谱中出现的凸起和下凹的小峰，则分析物无需换液，直接进行SPR检测；如果要消除图谱中出现的凸起和下凹的小峰，需要先换液后再进行SPR检测。
[0015]具体的，所述分析物的溶剂效应是由高折光率添加剂产生，所述高折光率添加剂选自海藻糖、甘露醇、蔗糖、甘油或氨基酸等中的任意一种或多种。
[0016]在一种具体的实施方案中，所述高折光率添加剂为海藻糖。
[0017]在一种具体的实施方案中，所述高折光率添加剂为甘露醇。
[0018]在一种具体的实施方案中，所述高折光率添加剂为蔗糖。
[0019]在一种具体的实施方案中，高亲和力的分析物的相互作用对为Trastuzumab
‑
Human HER2。其亲和力在0.1nM左右。
[0020]在一种具体的实施方案中，中亲和力的分析物的相互作用对为mAb1
‑
Ag1。其亲和力在50nM左右。
[0021]在一种具体的实施方式红，低亲和力的分析物的相互作用对为Rituximab
‑
CD32a(H167)。其亲和力在3000nM左右。
[0022]本专利技术中，对于任一待检测的分析物，其bulk读取的是分析物最高工作浓度结合阶段结束前5秒时在参比通道上的信号值
[0023]本专利技术中，对于任一待检测的分析物，其R0读取的是分析物最高工作浓度结合阶段结束前5秒时配体通道扣减参比通道后的信号值。
[0024]本申请中，研究人员在实验中偶然发现，分析物溶剂中含一定含量海藻糖时，换液前后并不影响实验结果，解析得到的亲和力常数基本一致。因此，有必要研究基于SPR技术的分析物缓冲液中由糖含量产生的溶剂效应对亲和力实验的影响程度，以判断是否换本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过评估分析物的溶剂效应对亲和力实验的影响程度来指导SPR检测前处理的方法，其特征在于，包括：1)所述分析物取样，检测bulk和R0，其中，bulk是指所述分析物最高工作浓度结合阶段时在参比通道产生的信号，且bulk<3500RU，R0是指分析物最高工作浓度在结合阶段时配体通道扣减参比通道后结合信号值；计算bulk/R0比值；2)对于高亲和力、中亲和力的反应，当bulk/R0≤10时，分析物无需换液，直接进行SPR检测；当10<bukl/R0<50时，根据对于图谱的要求，决定是否换液；当bulk/R0≥50时，需要先换液再进行SPR检测；对于低亲和力的反应，当bulk/R0≤10时，分析物无需换液，直接进行SPR检测；当10<bukl/R0<20时，可根据对于图谱的要求，决定是否换液；当bulk/R0≥20时，需要先换液后再进行SPR检测；其中，高亲和力是指分析物的相互作用对K
D
<1nM，中亲和力是指分析物的相互作用对1nM≤K
D
≤100nM，低亲和力是指分析物的相互作用对K
D
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【专利技术属性】
技术研发人员：单雪莲，荣乃燕，王卓智，
申请(专利权)人：上海药明生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：