一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法及其应用，属于基因工程技术领域；本发明专利技术提供所述云雾贡茶CsPPO基因的克隆，所述云雾贡茶CsPPO过表达载体的构建及烟草的遗传转化等步骤，利用荧光定量PCR对转基因烟草进行分析，低温胁迫促使云雾贡茶CsPPO表达量提高。当CsPPO在烟草植株中过量表达时，通过抗寒生理指标测定结果分析，植株的抗寒性得到提高。与现有技术相比，本发明专利技术为首次公开云雾贡茶CsPPO的克隆方法，为茶树抗逆品种选育以及基因辅助育种奠定基础。因辅助育种奠定基础。因辅助育种奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法及其应用。

技术介绍

[0002]云雾贡茶[Camellia Sinensis(L.)Kuntze var.niaowangensis Q.H.Chen]良种分布在贵州省贵定县南部云雾山地区。云雾山具有独特的生态环境优势，海拔1583.6m，终年云雾缭绕，泉水清澈，溪流交错，独特的生态环境孕育了云雾贡茶独特茶香“嫩栗香”，富含有机锗、茶多糖。云雾贡茶栽培种植历史悠久，早在唐朝就被茶圣陆羽收录记载，元泰定二年(公元1325年)开始向朝廷贡茶，至明清更成为皇家珍品，乾隆时列为全国八大名茶之一。近年来，用云雾贡茶制作的贵定雪芽连获国际金奖，成为国际名茶，是国内目前仅存贡茶碑记载的名优茶种。
[0003]多酚氧化酶PPO是一种金属蛋白酶，在茶叶加工制作过程中起着至关重要的作用，它可将茶叶中的多酚类物质酶促氧化成茶黄素、茶红素等关键品质成分物质，对红茶的品质产生重要影响。根据文献可知，多酚氧化酶主要与植物的抗逆性相关。但在茶树生长过程中，多酚氧化酶是否参与茶树抵抗外界胁迫、或在植物次生代谢途径上起到的作用，却并不明确。目前讨论最多的有关其生理功能是，多酚氧化酶与茶树的抗病性、抗虫性、光保护与光合作用之间的关系。多酚氧化酶通过氧化多酚类物质形成醌类物质，继而通过非酶促反应的聚合，最终导致植物体发生颜色的变化。这种反应，在植物抵御外来侵害中发挥重要作用。但是环境因素对PPO活性的影响，如极端的温度、湿度等方面的研究较少，所以探究茶树中多酚氧化酶在低温胁迫条件下的表达分析有着重要的理论与实际意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法，具体包括以下步骤：
[0007]先提取云雾贡茶叶片总RNA后反转录为cDNA，以反转录的cDNA为模板，利用引物
[0008]PPO
–
Forward3：GGCACATCCCAAACAAAATA，
[0009]PPO
‑
Reverse2:：CCGCTCGAGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA，
[0010]将扩增所得产物进行TA克隆系统的克隆以及测序后，选择4号以及15号克隆作为模板进行分段扩增，分段扩增后再选取4号克隆PCR产物和15号克隆PCR产物作为模板进行融合PCR，得到云雾贡茶CsPPO基因。
[0011]进一步地，所述以4号克隆为模板进行分段扩增所用引物序列为：
[0012]PPO
‑
Forward5:TGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAATTCTCTTCCACCATCAAGC，
[0013]PPO
‑
Reverse3:AGCTTGGCAGTCTTACTACTCGA；
[0014]以15号克隆为模板进行分段扩增所用引物序列为：
[0015]PPO
‑
Forward2：TCGAGTAGTAAGACTGCCAAGCT，
[0016]PPO
‑
Reverse5：ATCATCATCTTTGTAATCCCCGGGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA。
[0017]进一步地，所述融合PCR扩增反应中所用PCR引物为：
[0018]PPO
‑
Forward5：TGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAATTCTCTTCCACCATCAAGC，
[0019]PPO
‑
Reverse5：ATCATCATCTTTGTAATCCCCGGGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA。
[0020]本专利技术还提供一种云雾贡茶CsPPO基因在提高植物抗寒能力中的应用，其特征在于，将所述云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法克隆的得到的云雾贡茶CsPPO基因整合进入植物中构建转基因植物，使得所述云雾贡茶CsPPO基因在转基因植物中表达以提高植物的抗寒能力，所述云雾贡茶CsPPO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0021]进一步地，所述构建转基因植物包括以下步骤：
[0022](1)构建含有云雾贡茶CsPPO基因的重组表达载体；
[0023](2)对步骤(1)所构建的重组表达载体进行鉴定，确保云雾贡茶CsPPO基因存在于该表达载体中；
[0024](3)将步骤(2)中鉴定正确的重组表达载体转化至农杆菌GV3101中；
[0025](4)通过步骤(3)获得的含有重组表达载体的农杆菌侵染植物，最终使云雾贡茶CsPPO基因在植物中表达。
[0026]进一步地，步骤(1)所述重组表达载体的构建方法为：
[0027]将云雾贡茶CsPPO基因与经XbaI和SmaI双酶切的表达载体CaMV35S::E3
‑
FLAG(PBI121)通过同源重组以及酶切连接方式构成重组表达载体。
[0028]进一步地，所述表达载体CaMV35S::E3
‑
FLAG(PBI121)包括：Kan
+
抗性基因、多克隆位点、CaMV35S强启动子以及3
×
FLAG标签。
[0029]进一步地，步骤(3)所述重组表达载体转化至农杆菌GV3101的具体步骤为：
[0030]将重组表达载体加到含农杆菌GV3101的离心管中，先冰浴40min，再液氮冷冻1min以及37℃热激5min处理后，将离心管加入500μL无抗生素LB液体培养基，于28℃摇床160rpm培养2h后将菌液涂布于含抗生素的LB固体培养基中，28℃，静置2d筛选并进行PCR鉴定获得重组工程菌。
[0031]进一步地，所述LB固体培养基中所含抗生素为卡那霉素、庆大霉素以及利福平。
[0032]进一步地，步骤(4)所述含有重组表达载体的农杆菌侵染植物的具体步骤为：
[0033](1)制备无菌的外植体；
[0034](2)将含有重组表达载体的农杆菌进行扩繁，获得菌液；
[0035](3)将步骤(1)制备的外植体置于步骤(2)扩繁后的农杆菌菌液中，经共培养、芽诱导分化、生根以及抗性植株筛选后，最终获得含云雾贡茶CsPPO基因的转基因植株。
[0036]本专利技术公开了以下技术效果：
[0037]本专利技术利用融合PCR扩增技术从云雾贡茶中克隆得到了多酚氧化酶基因CsPPO，可用于CsPPO的重组表达和基因转移，为茶树抗逆品种选育以及基因辅助育种奠定基础。
附图说明
[0038]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法，其特征在于，具体包括以下步骤：先提取云雾贡茶叶片总RNA后反转录为cDNA，以反转录的cDNA为模板，利用引物PPO
–
Forward3：GGCACATCCCAAACAAAATA，PPO
‑
Reverse2:：CCGCTCGAGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA，将扩增所得产物进行TA克隆系统的克隆以及测序后，选择4号以及15号克隆作为模板进行分段扩增，分段扩增后再选取4号克隆PCR产物和15号克隆PCR产物作为模板进行融合PCR，得到云雾贡茶CsPPO基因。2.根据权利要求1所述的克隆方法，其特征在于，所述以4号克隆为模板进行分段扩增所用引物序列为：PPO
‑
Forward5:TGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAATTCTCTTCCACCATCAAGC，PPO
‑
Reverse3:AGCTTGGCAGTCTTACTACTCGA；以15号克隆为模板进行分段扩增所用引物序列为：PPO
‑
Forward2：TCGAGTAGTAAGACTGCCAAGCT，PPO
‑
Reverse5：ATCATCATCTTTGTAATCCCCGGGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA。3.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，所述融合PCR扩增反应中所用PCR引物为：PPO
‑
Forward5：TGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAATTCTCTTCCACCATCAAGC，PPO
‑
Reverse5：ATCATCATCTTTGTAATCCCCGGGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA。4.一种云雾贡茶CsPPO基因在提高植物抗寒能力中的应用，其特征在于，将权利要求1所述云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法克隆的得到的云雾贡茶CsPPO基因整合进入植物中构建转基因植物，使得所述云雾贡茶CsPPO基因在转基因植物中表达以提高植物的抗寒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，赵德刚，王济红，席培宇，向准，万诚，李蕾嘉，李岩，赵丹，秦利军，
申请(专利权)人：贵州省生物研究所，
类型：发明
国别省市：