一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法及其应用，属于基因工程技术领域；本发明专利技术提供所述云雾贡茶CsPPO基因的克隆，所述云雾贡茶CsPPO过表达载体的构建及烟草的遗传转化等步骤，利用荧光定量PCR对转基因烟草进行分析，低温胁迫促使云雾贡茶CsPPO表达量提高。当CsPPO在烟草植株中过量表达时，通过抗寒生理指标测定结果分析，植株的抗寒性得到提高。与现有技术相比，本发明专利技术为首次公开云雾贡茶CsPPO的克隆方法，为茶树抗逆品种选育以及基因辅助育种奠定基础。因辅助育种奠定基础。因辅助育种奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法及其应用。

技术介绍

[0002]云雾贡茶[Camellia Sinensis(L.)Kuntze var.niaowangensis Q.H.Chen]良种分布在贵州省贵定县南部云雾山地区。云雾山具有独特的生态环境优势，海拔1583.6m，终年云雾缭绕，泉水清澈，溪流交错，独特的生态环境孕育了云雾贡茶独特茶香“嫩栗香”，富含有机锗、茶多糖。云雾贡茶栽培种植历史悠久，早在唐朝就被茶圣陆羽收录记载，元泰定二年(公元1325年)开始向朝廷贡茶，至明清更成为皇家珍品，乾隆时列为全国八大名茶之一。近年来，用云雾贡茶制作的贵定雪芽连获国际金奖，成为国际名茶，是国内目前仅存贡茶碑记载的名优茶种。
[0003]多酚氧化酶PPO是一种金属蛋白酶，在茶叶加工制作过程中起着至关重要的作用，它可将茶叶中的多酚类物质酶促氧化成茶黄素、茶红素等关键品质成分物质，对红茶的品质产生重要影响。根据文献可知，多酚氧化酶主要与植物的抗逆性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法，其特征在于，具体包括以下步骤：先提取云雾贡茶叶片总RNA后反转录为cDNA，以反转录的cDNA为模板，利用引物PPO
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Forward3：GGCACATCCCAAACAAAATA，PPO
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Reverse2:：CCGCTCGAGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA，将扩增所得产物进行TA克隆系统的克隆以及测序后，选择4号以及15号克隆作为模板进行分段扩增，分段扩增后再选取4号克隆PCR产物和15号克隆PCR产物作为模板进行融合PCR，得到云雾贡茶CsPPO基因。2.根据权利要求1所述的克隆方法，其特征在于，所述以4号克隆为模板进行分段扩增所用引物序列为：PPO
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Forward5:TGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAATTCTCTTCCACCATCAAGC，PPO
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Reverse3:AGCTTGGCAGTCTTACTACTCGA；以15号克隆为模板进行分段扩增所用引物序列为：PPO
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Forward2：TCGAGTAGTAAGACTGCCAAGCT，PPO
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Reverse5：ATCATCATCTTTGTAATCCCCGGGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA。3.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，所述融合PCR扩增反应中所用PCR引物为：PPO
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Forward5：TGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAATTCTCTTCCACCATCAAGC，PPO
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Reverse5：ATCATCATCTTTGTAATCCCCGGGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA。4.一种云雾贡茶CsPPO基因在提高植物抗寒能力中的应用，其特征在于，将权利要求1所述云雾贡茶CsPPO基因的克隆方法克隆的得到的云雾贡茶CsPPO基因整合进入植物中构建转基因植物，使得所述云雾贡茶CsPPO基因在转基因植物中表达以提高植物的抗寒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，赵德刚，王济红，席培宇，向准，万诚，李蕾嘉，李岩，赵丹，秦利军，
申请(专利权)人：贵州省生物研究所，
类型：发明
国别省市：